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       【摘要】 
       目的研究连翘的抗氧化作用，并分离、鉴定连翘抗氧化有效成分。方法用二苯代苦味肼基自由基 ［1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)］ 清除实验方法，对连翘的甲醇提取物及其二氯甲烷、正丁醇、水的萃取物进行抗氧化作用评价，并从有效部位分离得到化合物。结果与结论连翘的二氯甲烷萃取物具有很强的清除DPPH自由基的抗氧化活性，并从中分离、鉴定4个化合物，分别为连翘脂素(phillygenin)、连翘苷(phillyrin)、forsythialan A 、连翘酯苷 (forsythoside A)。其中，forsythialan A和连翘酯苷 (forsythoside A)具有较强的DPPH清除作用，其半数有效值IC50分别为154.05和69.80 μg/ml。
       【关键词】  连翘； 抗氧化； DPPH； forsythialan A； 连翘酯苷
       Antioxidants from Forsythia suspensa
       PIAO Xianglan, WU Qian, TIAN Yanze
       Institute of Chinese Minority Traditional Medicine, Minzu University of China, Beijing 100081,China
       Abstract：ObjectiveTo investigate the antioxidative activity of Forsythia suspensa and to isolate and identify the active components. MethodsDPPH radical scavenging activity was tested for the MeOH extract and its CH2Cl2, BuOH, H2O fractions.Results and ConclusionCH2Cl2 fractions from F. suspensa appeared potent antioxidant effects against the DPPH radical. Four components were isolated and identified as phillyrin, forsythialan A and forsythoside A, respectively. Forsythialan A and forsythoside have strong antioxidant activity and the IC50 values were 154.05 and 69.80 μg/ml, respectively.
       Key words： Forsythia suspensa;   Antioxidant;   DPPH;   Forsythialan A;   Forsythoside A
        现代医学研究已经证实氧化性应激大约与两百多种疾病的发生有关, 其中包括自身免疫性疾病、糖尿病、白内障、癌症等的产生与发展都可由自由基及其代谢产物诱发［1］。生物体具有有效的防御系统来保护它们，免遭活性氧或其它自由基导致的紊乱与疾病［2～4］。然而，自由基形成与抗氧化防御系统之间出现不平衡，过多的氧化压抑，远超过防御机制能力，出现酶抗氧化防御的活性减小或在血清中的抗氧化剂浓度降低［5～7］。生物体内过量的氧自由基会造成生物膜损伤、蛋白质变性、酶失活及DNA复制出现错误等，这些势必导致一系列疾病，如血管粥样硬化、高血压病、糖尿病、癌、帕金森病、老年痴呆症、衰老等。这时抗氧化剂就起到非常重要的角色。抗氧化防御系统是靠消除活性氧或使活性氧非活性化来完成［8～10］。所以人们更多地关心这种酶抗氧化体系活性的提高或可以直接消除活性氧的抗氧化剂。现在研究主要集中在类似α-lipoic acid、coenzyme Q10、GSH等人体内细胞水平形成的抗氧化剂，或如维生素 C、维生素 E等人体内不形成但通过食物、天然物摄入多种多样的抗氧化剂［11］。但是合成的抗氧化剂，不仅是因为它本身的毒性，还有在高浓度摄取等都可以引起有害身体的问题，而且已有很多研究说明吃药不如通过天然物摄取抗氧化剂，因此越来越多的研究者关心天然抗氧化剂。
        中药连翘为木犀科连翘属植物连翘 Forsythia suspensa (Thunb. )Vahl的干燥果实，始载于《神农本草经》，性平，气微香，味微苦，具有清热解毒、疏散风热、消痈散结、强心利尿和降血压之功效，主产于我国东北、华北、长江流域至云南等地，其中以山西晋南，河南豫西所产不但色泽鲜亮且质量佳，为道地药材。连翘是我国常用的大宗药材，主要含有连翘酚( forsythol)、连翘苷(Phillyrin)、连翘苷元(phillygenin)、齐墩果酸( oleanolic acid, OLA)、白桦脂酸(betulinic acid)、乌索酸(ursolic acid,UA)、松脂素(pinoresinol)、甾醇化合物、马苔树脂醇苷(matairesinoside)和多种烃类、醛酮类、醇酯醚类挥发性成分［12］。现代药理研究表明，连翘具有广谱抗菌、抗病毒等作用，对丹毒、颈淋巴结结核、尿路感染、扁桃体炎、肾炎双球菌等均有抑制作用，常用于急性胃炎，呼吸道感染等病症。国内有连翘败毒片、复方鳖甲软肝片、复方金连片、双黄连口服液、复方金银花冲剂等连翘复方制剂。
        虽然对连翘的抗氧化活性报道了一些，但对连翘的活性氧消除作用及对氧化应激保护作用的活性物质的研究还不多。因此，对糖尿病、癌、动脉硬化、老年痴呆以及老化等诸多疾病起主要因素的氧化应激，进行阐明连翘抗氧化性能，是很有研究意义的。所以，本研究利用体外二苯代苦味肼基自由基［1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)］清除方法，来探讨连翘的抗氧化效果，并分离、鉴定有效成分。
       1  材料
        1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 购自日本Wako Pure Chemical Industries, Ltd.，分离用硅胶（200～400目）购自青岛化工厂，连翘果实购于北京同仁堂药店，并经本教研室鉴定为Forsythia suspensa果实。所有试剂均为分析纯。
       2  方法
       2.1  连翘的提取与分离连翘根（500 g），用 8，6，6倍量的 80% MeOH加热回流提取 3次，每次 3 h，合并3次提取液，减压浓缩，真空干燥，得甲醇提取干膏 84.5 g。甲醇提取物用 500 ml的水混悬，依次用二氯甲烷（3次）、正丁醇（3次）萃取，得二氯甲烷萃取物 45.3 g。
       2.2  连翘抗氧化有效成分的分离取连翘二氯甲烷萃取物 (24 g)进行硅胶柱色谱，醋酸乙酯-甲醇（100∶1 ～ 2∶1）梯度洗脱，薄层色谱配合检识，得到6个组分（Fr. 1～6）。Fr. 4再经硅胶柱色谱，三氯甲烷-甲醇（20∶1）洗脱，重结晶，得到化合物1（20 mg），2（98 mg），3（20 mg），4（25 mg）。
       2.3  DPPH自由基消除活性抗氧化活性是参照文献［13］稍加修改后用光谱仪检测。用乙醇溶解的不同浓度的样品100 μl与120 μmol/L DPPH溶液 100 μl，加入96孔板中，混匀后，室温放置30 min，然后在517 nm处测吸收度。DPPH 自由基水平用 microplate reader (SPECTRAmax 340PC, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) 测定。用百分率与不加样品的对照组进行自由基消除效果的比较，然后用半数抑制率IC50（抑制50%的DPPH自由基生成所需样品的浓度）表示抗氧化活性。
       2.4  统计学方法每组结果以±s表示，控制组与样品处理组间通过SAS 8.1 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)软件，用one-way ANOVA分析数据。P < 0.05则可认为组间具有统计学的显著差异。
       3  结果
       3.1  体外DPPH消除作用DPPH自由基(二苯代苦味肼基自由基, 1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl)是一种稳定的以氮为中心的质子自由基，其乙醇溶液呈紫色，并在517 nm 处有强烈吸收，在有自由基清除剂存在时，自由基清除剂提供一个电子与DPPH 的孤对电子配对，而使其褪色，褪色程度与其接受的电子呈定量关系，在517 nm处的吸光度变小，其变化程度与自由基清除程度呈线性关系，即自由基清除剂的清除自由基能力越强，吸光度越小。
        连翘甲醇提取物及其不同溶剂萃取物均有浓度依赖性的 DPPH 消除作用，尤其是二氯甲烷萃取物具有较强的DPPH 消除作用（见图 1）。
        如图所示，不同浓度的连翘的甲醇提取物以及其二氯甲烷萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物均显示出剂量依赖性地DPPH 自由离子基消除活性（P< 0.05）。尤其是二氯甲烷萃取物对DPPH自由离子基的产生具有最强的抑制作用（P< 0.05），在100 μg/ml浓度就清除75%的DPPH，在各萃取组分中活性最强，可判断为活性成分集中在连翘的二氯甲烷萃取物中。
       3.2  连翘有效成分的鉴定从连翘二氯甲烷萃取物中，分离得到4个化合物。根据它们的理化性质及其质谱、1H-NMR、13C-NMR，与文献［14～16］一致，被鉴定为连翘脂素 (phillygenin)、连翘苷(phillyrin)、forsythialan A 、连翘酯苷 (forsythoside A) (见图2)。
       3.3  连翘有效成分的鉴定对所分离的4个化合物进行DPPH自由基清除活性检测，结果forsythianlan A和连翘酯苷 (forsythoside A) 具有较高的DPPH清除活性（见表1）。它们的半数抑制率 （IC50）分别为154.05和69.80 μg/ml，而其它两个化合物的半数抑制率超过200 μg/ml。表1  连翘有效成分的DPPH自由基清除作用(略)
       4  讨论
        活性氧自由基是生物体生命活动过程中由机体生物化学反应所产生的中间产物，是一些处于激发态的含氧基团，在生物体衰老与疾病、正常的免疫代谢、细胞信号传导等过程中都起着重要的作用。在正常情况下，体内自由基的产生和清除是平衡的，一旦自由基产生过多或抗氧化体系出现故障，体内自由基代谢可能失衡，从而导致脂质过氧化、细胞损伤、DNA断裂等。研究发现，生物体的多种疾病都与自由基对机体的氧化损伤有关。抗氧化剂或自由基清除剂能有效抑制或缓解自由基对机体的不利影响，起到防病、治病和延缓衰老的作用，因此寻找和开发能够清除氧自由基的抗氧化剂成为当前许多学科研究的热点。
        本实验采用了DPPH自由基清除活性方法来测定连翘各组分的抗氧化活性，这种方法在国外广泛用于植物材料的总抗氧化活性的评价和抗氧化剂的筛选。DPPH是一种稳定存在的有机自由基，由于苯环的内轭和位阻及硝基的吸电子作用，呈现紫色，被还原后变为浅黄色，通过测定反应体系在517 nm附近的吸收峰的下降程度可以直接评价其抗氧化活性，变化程度与自由基清除程度呈线性关系。该方法简便易行，且灵敏度高。
        实验结果表明，连翘的甲醇提取物及其二氯甲烷、正丁醇和水萃取物都具有一定的抗氧化活性。甲醇提取物和二氯甲烷萃取物具有较强的抗DPPH自由基活性，尤其是二氯甲烷萃取物具有最强的抗氧化活性（P<0.05），从中分离、鉴定了有效成分forsythialan A和连翘酯苷，但其确切的作用机制尚需进一步实验证实。在接下来的实验中，课题组将结合化学成分研究配合现代药理学跟踪，对获得的主要成分进行深入研究，为其开发利用提供化学和药理学依据，以便扩大我国药用资源的开发和利用。
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