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       【摘要】 
       目的分离鉴定菱角皮中抑制肿瘤细胞活性的成分。方法采用MTT法对菱角皮提取物抗肝癌HepG2细胞活性成分进行活性追踪，采用液－液萃取提取活性部位，采用反相C18柱层析和Sephadex LH20排阻层析分离活性成分，用核磁和质谱等方法确定化合物结构。结果从菱角皮85％乙醇提取物中分离得到两个主要成分，经质谱和核磁数据分析鉴定其结构为1, 2, 6-三没食子酰-β-D-葡萄糖（1）和1, 2, 3，6-四没食子酰-β-D-葡萄糖（2）。MTT法分析表明，这两个化合物在400 μg/ml测试浓度下对肝癌HepG2细胞分别有44.2％和30.4％抑制率。结论化合物1和2为首次从菱角皮中分离得到，这两个化合物对肝癌HepG2细胞生长的抑制活性也为首次报道。
       【关键词】  菱； 菱角皮； 1, 2, 6-三没食子酰-β-D-葡萄糖； 1, 2, 3，6-四没食子酰-β-D-葡萄糖； 抑制肿瘤细胞生长
       菱Trapa bispinosa Roxb为菱科（Trapaceae）菱属一年生浮水或半挺草本植物，产于全国各地，以长江流域亚热带地区分布和栽培最多［1］。菱食用只选用菱肉部分，其加工过程的下脚料菱角皮常被丢弃。菱角皮，也称菱壳，其药用始载于《本草纲目拾遗》。据《中华药海》所载，菱角皮性味微苦、涩，性凉，入肺、脾、大肠三经，具有解毒疗疮、涩肠止泻、清化湿热的功效［2］，但至今对其活性成分和药理作用研究少见报道。我们注意到已有的研究表明东北菱醇提取物和水提取物均具有抑制肝癌细胞的作用［3～5］，为此，为进行菱角皮的药用开发，我们对菱角皮醇提取物进行了抗肿瘤活性筛选，初步研究表明其具有抗肿瘤活性。在此基础上，对其提取物进行活性追踪分离，得到两个具有抗肿瘤活性的鞣质类化合物。本文介绍这两个化合物的提取分离、结构鉴定和初步活性分析结果。
       1  仪器与材料
          
       熔点用X-4型显微熔点测定仪测定（未校正）；紫外（UV）用岛津2540型紫外分光光度计测定。红外光谱（IR）用JASCO FT/IR-480红外光谱仪（KBr压片）测定；NMR用BRUKER AV-400 FT型核磁共振仪测定；ESI-MS用Finnigan LCQ Advantage MAX质谱仪测定；HPLC采用岛津HPLC色谱仪系统。CO2培养箱，美国SHELDON公司产品；MK3型酶标仪，芬兰雷博公司产品；96孔培养板，美国Corning Costar公司产品；所用溶剂和试剂均为分析纯；大孔树脂为R－A型，北京化工三厂产品；柱层析用反相C18填料为日本YCM公司产品；反相硅胶薄层预制板为TLC aluminum sheets (20 cm×20 cm) RP-18F254, Merck（德国）公司产品；Sephadex LH-20，Amersham Biosciences（瑞士）产品；人肝癌HepG2细胞, 暨南大学医学院病理教研室提供; 小牛血清, 杭州四季青生物工程材料有限公司产品; RPMI1640培养基, 美国GIBCO公司产品。
       
       菱角皮（菱壳）为任先达教授提供，购自湖南省长沙市，经鉴定为菱科（Trapaceae）植物菱Trapa bispinosa Roxb成熟果实的果壳。
       
       2  方法
       2.1  提取与分离取菱角皮，粉碎成细粉，取粉末100 g，用5倍量85%乙醇冷浸2次，第1次为72 h，第2次为48 h，过滤前超声2 h，过滤，合并冷浸液，滤液低温（<60℃）减压回收乙醇，浓缩得菱角壳提取物。将此提取物用适量水（100 ml）混悬，再依次用石油醚（50 ml）、氯仿（50 ml）、醋酸乙酯（50 ml）萃取水分散混悬液各3次，减压下蒸干溶剂，得萃取物A、B和C。剩余水层以大孔树脂吸附处理，先以纯水冲洗至洗脱溶液完全无色，得700 ml溶液，蒸干，得洗脱物D；以50％乙醇冲洗至所得溶液完全无色，得200 ml溶液，蒸干，得洗脱物E；以95％乙醇冲洗至溶液完全无色，得200 ml溶液蒸干，得洗脱物F。取A、B、C、D、E、F各约10 mg进行抗肿瘤药理活性实验研究。药理实验结果（见后）表明C具有抑制肿瘤细胞增殖作用，为活性部位，用于进一步分离。将C（2.6 g）以7 ml的甲醇水溶液溶解后加到反相柱中，以25％甲醇水溶液～100％甲醇梯度洗脱，每50 ml为一流分收集，经反相薄层层析建立合并方案，得合并后流分F1～F13。将具细胞毒活性的F5和F6溶于适量甲醇，分别上葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱，以甲醇洗脱，得到化合物1 (50 mg)和2 (35 mg)。
       2.2  结构鉴定
       2.2.1  化合物1浅黄色晶体（甲醇），熔点258～260℃。 IR光谱: νmax (KBr) 3 530-3 100 (OH)，1 710 (CO), 1 612 (苯环) cm-1;  1H NMR（400 MHz, DMSO-d6）：δ 7.01 (2H, s, Ar3-H2,6), 6.92 (2H, s, Ar2-H2,6), 6.88 (2H, s, Ar1-H2,6), 5.90（1H，d, J=8.4 Hz, H-1）, 5.04 (1H, dd, J=9.2，8.7 Hz, H-2), 4.32 (1H, dd, J=4.7, 7.6 Hz, H-6a), 4.43(1H, d, J=10.7 Hz, H-6b)。δ3.70 (1H, dd, J=9.2，9.3 Hz, H-3), 3.52 (1H, dd, J=9.2，9.4 Hz, H-4), 3.82(1H, ddd, J=3.0，6.7，2.8 H, H-5), 13C NMR（100 MHz, DMSO-d6）：165.6 (6-Gall-C7), 164.8 (2-Gall-C7), 164.1(1-Gall-C7), 145.5 (1-Gall-C3,5), 145.5 (6-Gall-C3,5), 145.4 (2-Gall-C3,5), 139.3 (1-Gall-C4), 138.6 (2-Gall-C4), 138.5 (6-Gall-C4), 119.2 (6-Gall-C1), 119.0 (2-Gall-C1), 117.7 (1-Gall-C1), 108.9 (1-Gall-C2,6), 108.8 (2-Gall-C2,6), 108.6 (6-Gall-C2,6), 92.1 (Glc-C1), 74.8 (Glc-C3), 73.5 (Glc-C5), 72.6 (Glc-C2), 69.6 (Glc-C4), 62.9 (Glc-C6); ESI-MS m/z 635［M-H］-; 659 ［M+Na］+。化合物1的1H和13C NMR数据与文献［6］报道的基本一致，故确定化合物1为1, 2, 6-三没食子酰-β-D-葡萄糖。
       2.2.2  化合物2浅黄色晶体（甲醇），熔点228～230℃；IR νmax (KBr): 3 530～3 100 (OH)，1 710 (CO), 1 612 (苯环)cm-1; 1H NMR（400 MHz, DMSO-d6）δ 6.92 (2H, s, Ar6-H2,6), 6.91 (2H, s, Ar1-H2，6), 6.88 (2H, s, Ar3-H2，6), 6.81 (2H, s, Ar2-H2,6), 6.13 （1H，d, J=8.4 Hz, H-1）, 5.52 (1H, dd, J=9.6，9.5 Hz, H-2), 5.27 (1H, dd, J=8.4，7.9 Hz, H-3), 4.44 (1H, d, J=9.4 Hz, H-6a), 4.40 (1H, dd, J=7.8，4.4 Hz, H-6b)4.08 (1H, d, J=7.6 Hz, H-5) , 3.81 (1H, d, J=4.8 Hz, H-4),；13C NMR（100 MHz, DMSO-d6）δ 165.6 (6-Gall-C7), 165.0 (3-Gall-C7), 164.6 (2-Gall-C7), 163.9 (1-Gall-C7),145.5(1,3,6-Gall-C3,5),145.3 (2-Gall-C3,5), 139.4 (1-Gall-C4), 138.9 (2-Gall-C4), 138.5 (6-Gall-C4), 138.5 (3-Gall-C4), 119.9 (6-Gall-C1), 118.9 (3-Gall-C1), 118.1 (2-Gall-C1), 117.5 (1-Gall-C1), 108.9 (1-Gall-C2,6), 108.7 (2，3-Gall-C2,6),108.6 (6-Gall-C2,6), 92.0 (Glc-C1), 76.3 (Glc-C3), 74.8 (Glc-C5), 70.6 (Glc-C2)， 67.4 (Glc-C4), 62.8 (Glc-C6); ESI-MS m/z 787［M-H］-，811 ［M+Na］+。化合物2的1H和13C NMR数据与文献［6］报道的基本一致，故确定化合物2为1, 2, 3，6-四没食子酰-β-D-葡萄糖。
       2.3  抑制肿瘤细胞增殖活性分析
       2.3.1  实验方法取对数生长期的肿瘤细胞，接种于96孔培养板（细胞数为5×103/孔，200 μl/孔），待细胞完全贴壁后（4 h以上），再加入已配制好的浓度为400 μg/ml（DMSO终浓度为0. 1％）的化合物1、化合物2及醋酸乙酯萃取物，对照组为含0.1% DMSO的培养液， 5% CO2孵箱中培养48 h 后,每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μl，继续培养4 h后,1 000 r/min离心5 min，弃去孔内培养基，每孔加入DMSO 150 μl，37℃温度摇10 min，使其充分溶解，酶标仪570 nm 波长处测定吸光度A值, 计算各实验药物对细胞增殖的抑制率。
       2.3.2  实验结果MTT实验结果（见表1）显示，与正常对照相比，化合物1与化合物2对HepG2细胞有不同程度的抑制作用，与醋酸乙酯萃取物相比，化合物1对HepG2细胞的抑制作用更强。表1  对化合物1、化合物2和醋酸乙酯萃取物HepG2细胞的抑制作用（略）
       3  结论
          
       本实验分离并鉴定了菱角Trapa bispinosa Roxb.皮中的鞣质类化合物1, 2, 6-三没食子酰-β-D-葡萄糖(1)和1, 2, 4, 6-四没食子酰-β-D-葡萄糖(2)，所得的两个化合物均为首次从植物菱角中发现。对菱角皮提取物及分离得到的化合物1和2进行了抗肿瘤细胞毒活性实验，MTT法实验结果表明菱角皮醋酸乙酯提取物及化合物1和2对HepG2细胞有一定的抑制作用。
       
       致谢：暨南大学药学院中药及天然药物研究所李茜博士代测NMR，戴毅博士代测ESIMS，硕士生贺飞代测IR。暨南大学药学院2002级药学本科生黄珺珺、陈引环同学参加提取部分工作。本研究得到暨南大学本科生创新项目“菱角皮提取物的抗肿瘤作用的初步研究”部分经费支持。
       【参考文献】
         　［1］中国科学院植物研究所. 中国植物志，第53卷2分册［M］. 北京：科学出版社，2000：1.
       
       ［2］冉先德. 中华药海［M］. 哈尔滨：哈尔滨出版社，1993：1584.
       
       ［3］牛凤兰, 尹建元，董威严. 菱角中抗肿瘤活性成分的分离、提纯及结构鉴定［J］. 高等学校化学学报，2005, 26(5)：852.
       
       ［4］牛凤兰, 李晨旭，董威严. 东北菱提取物对肝癌细胞的体内外抑制作用J］. 吉林大学学报（医学版），2002, 30（4）：553.
       
       ［5］牛凤兰, 张秋月. 菱壳水提物对胃癌细胞抑制作用的实验研究J］. 白求恩医科大学学报，2001，27（5）：495.
       
       ［6］Nishizawa M, Yamagishi T, Nonaka G, et al. Tannins and related compounds. Part 9. Isolation and characterization of polygalloylglucoses from Turkish galls (Quercus infectoria) ［J］. Perkin Transactions 1, Organic and Bioorganic Chemistry, 1983, 5: 961.