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       【摘要】 
       目的考察硫熏干燥对菊花中有效成分的含量影响。方法采用HPLC法测定自然干燥和硫磺熏蒸干燥菊花中绿原酸、槲皮素、木犀草素的含量；采用分光光度法测定菊花中总黄酮的含量；采用盐酸－副玫瑰苯胺法测定各菊花中SO2的残留量。结果与自然干燥的菊花相比，硫熏菊花中的槲皮素、木犀草素和总黄酮含量低于前者，而绿原酸含量高于前者， SO2的残留量远远高于前者。结论硫磺熏蒸对菊花中有效成分的含量变化有一定的影响，建议产地加工时应限制使用硫熏干燥法。
       【关键词】  菊花； 硫熏干燥； 绿原酸； 槲皮素； 木犀草素； 总黄酮
       菊花是菊科植物菊花Chrysanthemum morifolium Ramat的干燥头状花序,为我国常用中药，具有疏风、清热、明目、解毒之功效。临床上主要用于治疗头痛、眩晕、目赤、心胸烦热、疔疮肿毒等症。目前市售的菊花多采用硫磺熏蒸的方法加以干燥，以达到漂泊、美化外观和防霉生虫等目的。但硫磺熏蒸后的药材是不利于入药的，因为其中残留的亚硫酸盐会对人体造成咽喉疼痛、胃部不适等伤害。此外，熏蒸后产生过多的SO2也会对大气造成严重污染。为考察硫磺熏蒸对菊花中绿原酸和黄酮类化合物含量的影响，今对自然干燥菊花与硫熏菊花中绿原酸、槲皮素、木犀草素及SO2的残留量进行了含量测定研究，为菊花资源的科学应用提供参考。
       1  仪器与材料
       1.1  仪器戴安UltiMate 3000高效液相色谱仪, UltiMate 3000四元泵，UltiMate 3000 variable wavelength 检测器，Chameleon工作站，KQ-250B超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），Spectrum922E型分光光度计。
       1.2  材料白菊花采自河北安国祁药标准化种植基地。芦丁对照品（100080-200707）、绿原酸对照品（110753-200403）、木犀草素对照品（111720-200603）、槲皮素对照品（100081-200406）均购自中国生物制品检定所。甲醇采用色谱醇，水为重蒸馏水，其余均为分析醇。
       2  方法与结果
       2.1  硫磺熏蒸菊花的制备将新采摘的菊花头状花序摊放于直径为90cm的带有支架的尼龙丝网圆筛中，把自制的体积约1.26 m3聚氯乙稀罩自上而下套在外面，距地面约为10 cm。将适量的硫磺置于陶瓷器皿中，点燃后迅速推入到垂直于圆筛的下方地面上，待其燃烧完全后，将聚氯乙稀罩下调至和地面充分接触，形成密封环境，保存12 h后取出，通风至干，备用。
       2.2  绿原酸的含量测定［1］
       2.2.1  色谱条件及系统适用性色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂； 0.1 mol/L 磷酸二氢钠溶液-甲醇（70∶30）为流动相；检测波长328 nm，流速1 ml/min。此条件下绿原酸的保留时间为6.61 min。
       2.2.2  对照品溶液的制备精密称取绿原酸对照品适量，置于棕色量瓶中，加水制成64 μg/ml，即得。
       2.2.3  供试品溶液的制备取菊花粉末约2 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇100 ml，称定质量，加热回流2 h，冷却，再称定质量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 ml，蒸干，残渣加入氯仿5 ml，浸3 min，弃去，加水适量溶解，转移至10 ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，微孔滤膜滤过，即得。
       2.2.4  标准曲线的制备分别精密吸取对照品品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，3.0 ml，定容至10 ml，摇匀。吸取以上溶液80 μl，注入液相色谱仪，定量20 μl测定。以峰面积对浓度进行回归，得回归方程：Y=1 085.824 67X -1.339 89（R=0.999 6），表明绿原酸在浓度0.064～0.382 mg/ml范围内线性关系良好。
       2.2.5  精密度实验取供试品溶液，重复进样5 次，记录绿原酸的峰面积，计算RSD=1.21%，表明精密度良好。
       2.2.6  重复性实验精密称取供试品5份，按“2.2.3”项下方法分别制成供试品溶液，进样分析，记录绿原酸峰面积，结果RSD=1.67%，结果表明本法重复性良好。
       2.2.7  稳定性实验取同一份供试品溶液，分别在0，2，4，6，8 h测定，记录绿原酸峰面积，计算RSD=1.33%，表面样品在8h内稳定。
       2.2.8  回收率实验精密称取供试品1.0 g，按高、中、低分别加入绿原酸，照“2.2.3”项下方法制备、测定，测得绿原酸平均回收率为97.51%，RSD=1.98%。
       2.2.9  样品的测定分别精密称取各种样品，按“2.2.3”项下方法，制成供试品溶液，注入高效液相色谱仪进行测定，记录绿原酸的峰面积，计算含量。结果见表1。表1  各菊花中绿原酸含量测定结果（略）
       2.3  槲皮素与木犀草素的含量测定［2］
       2.3.1  色谱条件及系统适用性试验十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相是甲醇-水（60∶40），用磷酸调pH值为3；检测波长253 nm，流速1 ml/min。此条件下槲皮素的保留时间为8.97 min，木犀草素的保留时间为10.72 min。
       
       2.3.2  对照品溶液的制备称取干燥至恒重的槲皮素与木犀草素对照品适量，用甲醇溶解，定容至50 ml，得质量浓度分别为0.016 4，0.018 mg/ml混合对照溶液，备用。
       2.3.3  供试品溶液的制备精密称取菊花粉末1 g，置锥形瓶中，加70%乙醇30 ml在60℃恒温水浴温萃30 min，冷却，抽滤，洗涤至100 ml量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，摇匀。精密吸取5 ml溶液，加入1ml浓度为4 mol/L的盐酸于80℃恒温水浴水解1h。用70%乙醇定容至10 ml，微孔滤膜滤过，即得。
       2.3.4  线性关系的考察精密吸取对照品溶液1，2，4，6，8 ml定容至10 ml。吸取上述溶液，注入液相色谱仪，定量20 μl，分析测定。以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：槲皮素为Y=1 584.431 7X+0.703 87(R=0.999 4)；木犀草素为Y=376.668 1X+0.581 2(R=0.999 6)，说明槲皮素在0.328～13.12 μg/ml浓度范围，木犀草素在0.36～14.44 μg/ml浓度范围内线性关系良好。
       2.3.5  精密度实验取供试品溶液，重复进样5 次，分别记录槲皮素和木犀草素峰面积， 计算RSD分别为1.86% 和1.91%，表明精密度良好。
       2.3.6  重复性实验精密称取供试品5份，按“2.3.3”项下方法分别制成供试品溶液，进样分析，记录槲皮素和木犀草素峰面积，结果RSD分别为1.89%和1.77%，结果表明本法重复性良好。
       2.3.7  加样回收率实验取一样品粉末，精密称取5份，分别加入混合标准溶液1 ml，按“2.2.3”项下方法制备、测定，测得槲皮素平均回收率为98.11%，木犀草素平均回收率为96.83%，RSD分别为1.94%和1.86%。
       2.3.8  样品的测定各样品按“2.3.3”项下方法，制成供试品溶液，注入高效液相色谱仪进行测定，记录槲皮素和木犀草素的峰面积，计算含量。结果见表2。表2   各菊花中槲皮素和木犀草素含量测定结果（略）
       2.4  总黄酮的含量测定［2］
       2.4.1  对照品溶液的制备称取芦丁适量，用70%乙醇溶解，置50 ml量瓶中，制成浓度为0.226 mg/ml溶液，备用。
       2.4.2  供试品溶液的制备精密称取菊花粉末1 g，置锥形瓶中，加70%乙醇30 ml在60℃恒温水浴温萃30 min，冷却，抽滤，洗涤至100 ml量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，摇匀。精密吸取3  ml于10 ml量瓶中，用30%乙醇定容，分别精密吸取2 ml于10 ml试管中，加5%亚硝酸钠溶液0.3 ml，振摇均匀放置6 min，再加10%硝酸铝，震荡均匀，放置6 min，再加4%氢氧化钠4 ml，，振荡摇匀，用30%乙醇定容，放置10 min后置比色皿中于510 nm处测定吸光值。以30%乙醇为空白溶液。
       2.4.3  标准曲线的制备精密吸取芦丁对照液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml，分别置10 ml量瓶中，加入5%亚硝酸钠溶液0.3 ml，振摇均匀放置6 min，再加10%硝酸铝0.3 ml，振荡均匀，放置6 min，再加4%氢氧化钠4 ml，振荡摇匀，用30%乙醇定容至刻度，振荡摇匀，放置10 min后采用分光光度法，在510 nm处测定吸光值，以对照品浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y=1.079 6X+0.032 8(R=0.991 5),说明芦丁在浓度0.226～1.13 mg/ml范围内线性关系良好。
       2.4.4  样品的测定按“2.4.2”项的方法制成供试品溶液，依法测定。结果见表3。表3  各菊花中总黄酮含量测定结果表（略）
       2.5  SO2残留量的测定［3］
       2.5.1  对照品溶液的制备称取0.5 g亚硫酸氢钠，溶于200 ml四氯汞钠吸收液中，放置过夜，上清液用定量滤纸过滤后用硫代硫酸钠标准溶液标定其浓度，再用四氯汞钠吸收液稀释成2 μg/ml做标准液。盐酸副玫瑰苯胺溶液；称取0.1 g盐酸副玫瑰苯胺于研钵中，加少量水研磨使溶解并稀释至100 ml。取出20 ml于100 ml容量瓶中，加浓盐酸8.0 ml混匀，待溶液由红变黄后稀释至该度备用。
       2.5.2  供试品溶液的制备精密称取3 g样品于100 ml容量瓶中，加20 ml四氯汞钠吸收液，放置过夜，加水稀释至刻度，过滤，弃去初滤液，滤液待测。
       2.5.3  亚硫酸氢钠标准溶液的标定吸取10 ml亚硫酸氢钠-四氯汞钠溶液于250 ml碘量瓶中，加100 ml水，准确加入20 ml 0.05 mol/L 碘溶液，5 ml冰醋酸，摇匀，置暗处 2 min后，迅速以 0.1mol/L Na2S2O3标准溶液滴定至淡黄色，加0.5 ml淀粉指示剂呈蓝色，继续滴定至无色。另取 100 ml碘量瓶，准确加入 20 ml 0.05 mol/L碘溶液，5 ml冰醋酸，按同一方法做试剂空白试验。
       2.5.4  标准曲线的制备 精密吸取0.2，0.4，0.8，1.2，1.6 ml SO2标准使用液，分别置于25 ml具塞比色管中，于标准管中各加入四氯汞钠吸收液至10 m，12 g/L氨基磺酸铵溶液1 m，10.4%甲醛溶液1 ml，盐酸副玫瑰苯胺溶液1 ml混匀。放置20 min，室温下用比色皿以零管调零，于波长550 nm处测吸光度，绘制标准曲线。得回归方程为：Y=0.039 5X-0. 0145 6，R=0. 999 6，样品在0. 4～3.2 μg/ml范围内有良好的线性关系。
       2.5.5  样品的测定按“2.5.2”项的方法制成供试品溶液，依法测定。结果见表4。表4  不同干燥方法菊花中SO2残留量结果（略）
       3  讨论
          
       由表1可知，硫熏菊花中绿原酸的含量要高于自然干燥的菊花，并且随着硫磺剂量的增多和熏蒸次数的增多，绿原酸含量也依次增高，这与菊花中存在的多酚氧化酶(PPO)有关。PPO是一类广泛存在于植物体内的能催化多酚类氧化成醌类的含铜质体金属酶，多分布于花、叶片、块茎、根等组织中。绿原酸是由咖啡酸与奎尼酸生成的缩酚酸，由于其分子结构中存在邻苯二酚结构，所以在有氧条件下极易被PPO氧化成醌类物质，产生褐变反应［4］。硫磺熏蒸产生大量的SO2使得菊花中亚硫酸氢盐的浓度增高，而亚硫酸氢盐如NaHSO3能够降低PPO的酶促反应强度，推迟反应时间。并且NaHSO3为还原剂，能将反应体系中的酚氧化产物醌进一步还原为酚，从而抑制了绿原酸被氧化，保证了绿原酸的含量。因而，硫熏菊花中绿原酸的含量要高于自然干燥的菊花。
       
       由表2和表3可知，硫磺熏蒸后，菊花中的槲皮素和木犀草素的含量下降，总黄酮含量也下降，但降低程度与硫磺用量未见明显规律。
       
       表4中，采用2 g硫磺熏干后的药材中SO2残留量约为自然干燥菊花中SO2量的5倍。自然干燥的菊花中也存在微量的SO2。原因是大气中存在的SO2可以进入叶片，这是植物吸收硫营养的次要形式。此外，土壤中的硫酸盐为植物提供了丰富的SO42-，进入植物体内的硫酸根离子在5"-腺苷磷酸硫酸还原酶的作用下［5］，还原成SO32-。因此，自然干燥的菊花中SO2残留量为0.172 4 mg/g。
       
       由于熏制药材所用硫磺多为天然品，含有一定量的二硫化二砷，燃烧后，二硫化二砷与空气中的氧发生反应，生成三氧化二砷，有损于人体健康,对肝肾功能不全者危害尤重［6］，同时还会使一些有效成分损失。
       
       虽然硫磺熏蒸可以使菊花中的绿原酸免受酶解破坏而起到保护作用，但考虑到硫熏药材中残留的亚硫酸盐对人体造成的多种伤害，建议产地加工时应限制使用硫熏干燥法。
       【参考文献】
         　［1］贾凌云，孙启时，黄顺旺.八大品种菊花中不同成分的含量比较［J］.中草药，2004,35(10):1180.
       
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       ［4］赵伶俐，范崇辉，葛红，等.植物多酚氧化酶及其活性特征的研究进展［J］.西北林学院学报，2005, 20(3): 156.
       
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       ［6］李林，张志杰，蔡宝昌. 硫熏对百合有效成分的影响［J］.上海中医药大学学报，2006，20(1):64.