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       【摘要】 
       目的优选沙苑子黄酮提取工艺。方法采用碱水、碱醇和乙醇提取，考察提取溶媒对沙苑子总黄酮提取的影响；采用石油醚脱脂后乙醇提取和直接乙醇提取，比较脱脂对沙苑子总黄酮提取的影响；并采用正交设计法优选乙醇提取工艺。结果以乙醇为溶媒，提取所得总黄酮含量最高；脱脂对提取有较大影响，脱脂后乙醇提取所得沙苑子总黄酮含量较高；乙醇提取最佳工艺条件为乙醇体积分数80%，料液比为1∶16，提取时间为1.5 h，沙苑子粒度为40目。结论优选出的提取工艺具有操作简便，可行性等特点。
       【关键词】  沙苑子； 提取工艺； 黄酮； 正交实验
       沙苑子为豆科植物扁茎黄芪Astragalus complanatus R .Br的种子，具有温补肝肾、固精、缩尿、益肝明目的功能；其性温而不燥和平柔润，补而不峻，平补肝肾，阴阳并补，唐代曾为上贡茶品。沙苑子主要含有黄酮类、三萜类、有机酸类、氨基酸、多肽、蛋白质、甾醇、多糖及铁、锌、锰、铜等微量元素。药理研究表明［1～6］，沙苑子具有保肝，降脂，降压，抑制血小板聚集，改变血液流变学指标，抗炎，增加非特异性特异性免疫功能、抗肝纤维化和抗肿瘤等作用，沙苑子黄酮为主要有效成分。该药安全有效，是治疗肝病很有前途的中药。为进一步开发利用沙苑子，本文以沙苑子苷A为对照品，比较了不同溶媒对沙苑子总黄酮提取的影响，脱脂对提取的影响，并采取正交设计法优选了沙苑子总黄酮乙醇提取的工艺条件，为更好地开发和利用沙苑子提供实验依据。
       1  仪器与试药
          
       UV-240PC(日本岛津出品),旋转蒸发仪(SENCO出品，R系列),真空干燥箱(DZF-6050)等。沙苑子苏州雷允上药业集团公司提供, 产地为陕西渭南，由苏州大学刘春宇教授鉴定为豆科植物扁茎黄芪Astragalus complanatus R.Br.的种子；其它化学试剂均为分析纯；沙苑子苷A（自制，含量98%以上）。
       2  方法和结果
       2.1  总黄酮含量测定［7］
       2.1.1  药材总黄酮含量测定
       
       供试品溶液制备：准确称取沙苑子粉末(过20目筛)2.0g,置索氏提取器中, 石油醚120 ml回流提取4 h, 药渣挥干溶剂, 置100 ml圆底烧瓶中, 准确加入80%乙醇60ml, 称定重量,于水浴85°C加热回流1.5 h, 取出放冷称重, 补充80%乙醇至原重量, 混匀, 放置, 吸取上清液20 ml备用。
       
       对照品溶液制备：精密称取沙苑子苷A对照品适量，加50%乙醇制成每毫升含沙苑子苷A 100  μg的溶液，即得。
       
       标准曲线的绘制：准确吸取沙苑子苷A对照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 ml分别置25ml容量瓶中，50%乙醇定容，于266 nm处测定吸收度。 以沙苑子苷A对照品溶液浓度为纵坐标，吸收度为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为:C=29.568 8A-0.843 6，r=0.999 9  ( n=6 ) 。结果表明，沙苑子苷A在4～24 μg/ml范围内呈线性关系。
       含量测定：精密吸取供试品溶液0.5 ml, 置25 ml容量瓶中, 50%乙醇定容后,  于266 nm处测定吸收度，以沙苑子苷A(C28H32O16)计算总黄酮含量。
       
       结果：本实验用沙苑子药材的总黄酮质量分数为3.56％。
       2.1.2  提取物总黄酮含量测定取沙苑子提取物80.0 mg，精密称定，置100 ml容量瓶中, 加50%乙醇适量，微热使溶解, 冷却后，定容至刻度。准确吸取溶液5 ml，置50 ml容量瓶中，50%乙醇定容至刻度，滤过，取续滤液，于266 nm处测定吸收度，以沙苑子苷A(C28H32O16)计算总黄酮含量和提取率。
       2.2  提取溶媒的选择
       2.2.1  碱水提取准确称取沙苑子粗粉150.0 g(40目),置圆底烧瓶中,加入2%NaOH水溶液回流提取2次，2 000 ml/次，1h，滤过，合并滤液，调pH值至中性后,减压回收溶剂,真空干燥。测定总黄酮含量和提取率。结果见表1。表1  不同溶媒对沙苑子黄酮提取的影响（略）
       2.2.2  碱醇提取将溶媒改为2%NaOH乙醇溶液(乙醇含量50%),同法回流提取, 测定总黄酮含量和提取率。结果见表1。
       2.2.3  乙醇提取将溶媒改为80%乙醇溶液，同法回流提取, 测定总黄酮含量和提取率。结果见表1。
       从表1可以看出，80%乙醇提取所得提取物沙苑子总黄酮含量和总黄酮量均最高，而碱水和碱醇提取不仅总黄酮含量和总黄酮量较低，而且干浸膏均为黑褐色硬膏状。实验结果表明，以乙醇为溶媒提取为佳。
       2.3  脱脂对提取的影响
       2.3.1  脱脂准确称取沙苑子粗粉150.0g(40目),置圆底烧瓶中，加入1 500 ml石油醚回流脱脂1 h后,滤过，滤渣挥干石油醚，加入80%乙醇回流提取2次，2 000 ml/次，1 h，滤过，合并滤液，减压回收溶剂，真空干燥。测定总黄酮含量和提取率。
       2.3.2  不脱脂按上法，直接加入80%乙醇回流提取2次，测定总黄酮含量和提取率。结果见表2。表2  脱脂对沙苑子总黄酮的影响（略）
       
       从表2可以看出，脱脂对沙苑子总黄酮提取有较大影响，石油醚脱脂后乙醇提取，提取沙苑子总黄酮百分含量和总黄酮量较高。结果表明，沙苑子总黄酮的提取应采用脱脂过程。
       2.4  乙醇提取工艺优选
       2.4.1  方法根据预试验结果确定沙苑子黄酮醇提工艺中考察的因素，以及各因素所取的水平范围，选定L9（34）正交表，对乙醇浓度（A），料液比（B），提取时间（C）和粒度（D）4个因素进行考察。见表3～4。准确称取沙苑子粗粉150 .0g（60目),置圆底烧瓶中,加入1 500 ml石油醚回流脱脂1 h，滤过，药渣挥去石油醚后,按正交实验表3～4的条件回流提取2次，滤过，合并滤液，减压回收溶剂，真空干燥。测定总黄酮含量和总黄酮量。
       2.4.2  结果与分析结果见表3～4。表3  因素水平，表4  沙苑子总黄酮提取实验及结果分析（略）。
       根据表4，由极差分析结果得知，对总黄酮量：各因素的主次分别为 D>B>A>C，最佳条件为: A3B3C2D3；对总黄酮含量：各因素的主次分别为A>D>B>C, 最佳条件为A3B3C2D3。综合这两个指标，并考虑到药材粒度太小过滤困难等因素，得出的最佳条件为A3B3C2D2，即乙醇体积分数为80%，料液比为1∶16，提取时间为1.5 h，粒度为40目，对总黄酮含量影响最小的是C因素，把C因素作为误差相处理，以总黄酮量为指标进行方差分析。结果见表5。表5  方差分析结果（略）
       2.4.3  验证性实验根据上述结果所得乙醇提取最佳工艺条件：A3B3C2D3，即乙醇浓度为80%,料液比为1∶16，提取时间为1.5 h，粒度为40目。为了验证工艺的稳定性，对最佳工艺条件进行了3次验证实验。结果见表6。表6  重复性实验结果（略）
       
       由表6可知，所得乙醇提取最佳工艺条件的重复性较好，平均总黄酮含量为5.13％，提取率为96.1％，优化工艺较为理想。
       3  讨论
          
       本研究结果，脱脂对沙苑子总黄酮的提取有较大影响，脱脂后沙苑子黄酮提取率明显提高；对提取溶媒的考察，结果乙醇提取优于碱水和碱醇提取；通过正交实验优选的乙醇提取的工艺条件为乙醇体积分数为80%，料液比为1∶16，提取时间为1.5h，沙苑子粒度为40目，优选工艺具有较好的重复性。
       
       黄酮类成分大多具有酚羟基，因此可用碱性水（如碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、氢氧化钙水溶液等）或碱性稀醇（50％的乙醇）浸出。本实验结果碱水及碱醇提取法效率较低，可能与沙苑子黄酮的结构有关，沙苑子黄酮中主要含有沙苑子苷A（鼠李柠檬素-3.4’-O-β-D-双葡萄苷），由于其结构中只有一个游离羟基（5-OH），且易与4 位羰基形成分子内氢键，故酸性较弱，用碱水提取效果不理想。
       沙苑子含油约5%，由于油脂的存在影响沙苑子黄酮的溶出，故脱脂对提取有较大的影响；且油脂的存在影响提取物的外观性状和干燥。
       【参考文献】
         　［1］刘春宇，顾振纶，张克平，等.沙苑子黄酮抗CCl4大鼠肝纤维化作用及对IFN－γ，TGF-β1的影响［J］.中国药学杂志，2004，39（12）：910.
       
       ［2］Chun-Yu Liu, Zhen-Lun Gu, Wen-Xuan Zhou, et.al. Effect of astragalus complanatus flavonoid on anti-liver fibrosis in rats［J］. World Journal of Gastroenterology, 2005，11（37）：5782.
       
       ［3］刘春宇，顾振纶，杜崇民，等. 沙苑子黄酮抗裸鼠人肝癌移植瘤的实验研究［J］.中国药理学通报，2007，23（6）：781.
       
       ［4］刘春宇，顾振纶，杜崇民，等. 沙苑子抗肿瘤活性成分体内外筛选［J］.中草药，2007，38（7）：1052.
       
       ［5］刘春宇，顾振纶,杜崇民，等. 沙苑子黄酮对H22荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用及对免疫功能的影响［J］.中成药，2007，29（11）：1690.
       
       ［6］Ran-Wei Hu, Chun-Yu Liu,Chong-Min Du,et al.Induction od apoptosis in human hepatocarcinoma SMMC-7721 cells in vitro by flavonoids from Astragalus complanatus［J］. Journal of Ethnopharmacology, 2009，123(2):293.
       
       ［7］刘春宇,胡延维，孙雄华，等. 以沙苑子苷为对照品测定沙苑子总黄酮含量［J］.中国野生植物资源，2002，21（4）：57.