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       【摘要】 
       目的通过DPPH·法测定沙枣花超临界萃取物各组分的清除自由基的能力。方法采用超临界CO2萃取技术对沙枣花进行萃取，对萃取物依次用石油醚，醋酸乙酯，正丁醇进行萃取，通过DPPH法测定分离釜I和分离釜II的萃取物各组分的清除自由基的能力，进行定性和半定量的研究。结果分离釜II总的萃取物的清除能力明显大于分离釜I总的萃取物的清除能力，但是分离釜I的经石油醚萃取后的水层，醋酸乙酯层，正丁醇层，经醋酸乙酯和正丁醇萃取后的水层的清除能力分别大于了分离釜II各组分的清除能力。结论沙枣花超临界萃取物各组分对DPPH·均具有一定清除作用,且与体积浓度呈量效关系。
       【关键词】  沙枣花； 超临界二氧化碳萃取； DPPH·
       Scavenging Activity of Supercritical CO2 Extract of Flower of Elaeagnus Angustifolia against Free Radicals
       ZHANG Zhenhua, YU Wei, WANG Jiyun, WANG Jingxia, WANG Yan
       1. Ningxia Medical University,Yinchuan 750004, China; 2.Shanxi Medical University,Taiyuan  030001, China
       Abstract:ObjectiveTo study the scavenging activity of supercritical CO2 extract of flower of Elaeagnus angustifolia against DPPH.MethodsThe extraction was performed by ligroin,acetidin and n-butanol in turn,and the method of DPPH was adopted to compare the scavenging activity against free radicals by different parts of extracts of extracted caldron Ⅰ and  Ⅱ,and carried out qualitation and semiquantitative study.ResultsThe scavenging activity by other parts of extracts of extracted caldron Ⅱ was better than that of extracted caldron Ⅰ .ConclusionSupercritical CO2 extract of flower of Elaeagnus angustifolia can scavenge DPPH,and the scavenging activity has dose-effect relationship with volume concentration.
       Key words:flower of Elaeagnus angustifolia ；  Supercritical CO2 extraction；  DPPH·
        沙枣花为胡颓子科植物沙枣Elaeagnus angustifolia L.的花,主产于西北地区。宁夏沙枣树抗旱耐碱,具有很强的生命力,也是宁夏防风固沙的重要植物。每年5～6月,淡黄色的小花朵释放出浓郁的芳香气味,深受人们喜爱。椐宁夏中药志记载,沙枣花主要含山萘酚、花白素、脂肪油和少量挥发油,具有止咳平喘的功能,可用于治疗慢性气管炎［1］。已有学者以食用酒精为提取剂提取沙枣花中黄酮类化合物［2］，另有王永宁等［3］对黄酮化合物的清除羟基自由基进行了初步研究。本课题组的王妍教授对沙枣花进行了超临界萃取并对其芳香成分进行了研究［4］。本文对沙枣花进行了CO2超临界萃取，应用DPPH法对不同分离釜萃取物的不同组分进行了清除自由基的研究，为进一步对其清除自由基活性成分的筛选提供基础，以及为沙枣花的深度开发和综合利用提供技术支持和理论依据。
       1  仪器与材料
        HA062502221 型超临界萃取仪(南通华安超临界萃取有限责任公司制造) ; 721分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)；电子分析天平,分液漏斗。1,1二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH·）(日本东京化成工业株式会社)；无水甲醇（天津天江）；沙枣花采自宁夏银川地区,采回后立即在-20 ℃冷冻保鲜。
       2  方法
       2.1  超临界萃取沙枣花［5］称取100 g新鲜冻存的沙枣花放入1 L的萃取釜中，萃取压力20 MPa,萃取温度45℃,流量30 L/min ,动态萃取120 min 。从分离釜I (压力10 MPa ,温度55 ℃) 接收分离物I 共12.3 ml,标记为总萃取物1；从分离釜II (压力5 MPa ,温度30 ℃) 接收分离物II共21.7 ml，标记为总萃取物2。
       2.2  各组分的制备将总萃取物1倒入分液漏斗中，加入等体积的石油醚进行萃取，充分振荡，放置分层后，得到下层水液，同法再次萃取，最后的水层标记为水层1，保存石油醚层。同法对总萃取物2进行萃取 ，最后水层标记为水层2，保存石油醚层。
        量取5 ml的水层1于分液漏斗中，加入等体积的醋酸乙酯进行萃取两次，合并，得到醋酸乙酯层,自然挥发至5 ml,标记为醋酸乙酯层1；剩余水层中加入等体积的正丁醇萃取两次，合并，得到正丁醇层10 ml, 自然挥发至5 ml,标记为正丁醇层1，最后剩余水层标记为萃后水层1。
        量取5 ml的水层2于分液漏斗中，加入等体积的醋酸乙酯进行萃取两次，合并，得到醋酸乙酯层, 自然挥发至5 ml,标记为醋酸乙酯层2；剩余水层中加入等体积的正丁醇萃取两次，合并，得到正丁醇层, 自然挥发至5 ml,标记为正丁醇层2，最后剩余水层标记为萃后水层2。
       2.3  DPPH·标准曲线的制作准确称取［DPPH·］2.5 mg,用甲醇定容到100 ml,配制成质量浓度为2.5×10-2mg/ml的标准溶液,置冰箱中备用(现用现配)。分别取0，2，4，6，8，10 ml标准溶液,用甲醇定容至10 ml,最终质量浓度分别为0,5,10,15,20,25 μg/ml。测定上述标准溶液在515 nm波长处的吸光度,制作标准曲线(见图1)。其线性回归方程为:
        Y= 0.030 4X+2E-16,R2=0.999 7
       2.4  清除DPPH·的测定方法DPPH·在有机溶剂中是一种稳定的自由基,其甲醇溶液显深紫色,在515 nm处有强吸收。当其与抗自由基活性物质的孤对电子配对时,其吸收消失或减弱,通过测定吸收减弱的程度,可评价自由基清除剂的活性。
        对DPPH·自由基清除方法的测定参阅Brand-William(1995)［6］研究。分别取以上制备不同组分各20，40，60，80，100 μl，量取相应体积的浓度为1.01×10-1 mol/L的DPPH·溶液至4 ml。立即混匀，用比色皿,在515 nm波长处进行测定,在一定时间间隔内测定吸光度，直到读数稳定。
        通过公式来计算自由基抑制率
        清除率（%）=［1-A1/A0］×100%
        式中A0为未加式样的DPPH·在515 nm处的吸光度,A1为抗氧化性物质与DPPH·反应后的515 nm处的吸光度。
       3  结果
        按上述方法,测定其不同体积浓度，即4,8,12,16,24,32 μl/ml的各组分清除DPPH·的能力。结果见表1及图2～3。表1  沙枣花CO2超临界萃取物自由基清除能力的比较（略）
        由表1可看出，分离釜II总的萃取物的清除能力明显大于分离釜I总的萃取物的清除能力，但是经石油醚萃取后分离釜I的水层，醋酸乙酯层，正丁醇层，萃后水层的清除能力分别大于了分离釜II各组分的清除能力。
       
       由图2～3可以看出，分离釜I和II的各组分对DPPH自由基均有不同程度的清除活性，且与体积浓度具有明显的量效关系；并可以看出总萃取物经过石油醚萃取后自由基清除能力都有所减少，分离釜II的减少尤为明显；萃后水层的自由基清除能力明显强于醋酸乙酯层，正丁醇层，但醋酸乙酯层和正丁醇层之间的清除能力相差不大。
       4  讨论
        DPPH自由基法是判定药物体外抗氧化活性的经典实验方法。本研究结果表明,沙枣花各组分都可以清除DPPH自由基，但清除能力存在差异,其中水总萃取物>水层>萃后水层>醋酸乙酯层≈正丁醇层。总萃取物2的清除率明显大于总萃取物1，但经石油醚萃取后的水层2的清除能力大大减少，并小于水层1，说明总萃取物2的石油醚萃取物中也含有大量的清除DPPH自由基的物质。同时分离釜I与II的各组分对DPPH自由基的清除能力相比，两者之间有差异，可能是由于CO2超临界提取分离釜I和II的压力和温度的不同导致了各组分所含物质种类或含量的不同引起的。从结果可以看出，分离釜I和II的水层和萃后水层的清除自由基的能力都比较强，为以后的抗氧化活性成分的筛选提供了方向。
        本次实验结果说明了沙枣花中含有能够清除DPPH自由基的物质，具有抗氧化活性,可在定性，半定量的基础上作进一步的定量和筛选活性物质的研究；同时提醒我们，在利用超临界提取时可以通过控制分离釜I和II的压力和温度来达到初步的分离的效果，为我们进一步的清除自由基活性成分的筛选提供基础。
       【参考文献】
         　［1］邢世瑞.宁夏中药志,上卷［M］.宁夏:宁夏人民出版社,1990:674.
       
       ［2］石玉平,王永宁,郭 珍.沙枣花中黄酮类化合物的提取［J］.南京林业大学学报(自然科学版),2005,29(2):105.
       
       ［3］王永宁，石玉平，郭 珍 . 沙枣花中黄酮类化合物对羟基自由基的清除研究［J］.青海医学院学报,2003,4:281.
       
       ［4］王 妍. 超临界CO2流体萃取及气质联用研究宁夏沙枣花的芳香成分［J］.香料香精化妆品,2005,3：1.
       
       ［5］焦淑清,侯 巍,李来军,等.超临界二氧化碳萃取满山红中黄酮类物质的工艺研究［J］.时珍国医国药,2008,19（3）:610.
       
       ［6］Brand-Williams W,Cuvelier ME,Berset C.Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity［J］.Lebensm Wiss Technol, 1995,28(1):25.