文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的研究生脉饮与黄芩茎叶总黄酮合剂(以下简称生黄合剂)对病毒性心肌炎（VMC）小鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的影响，探讨其治疗VMC的免疫调节机制。方法Balb/c小鼠170只，随机分为正常组，生黄合剂治疗组、生脉饮组、抗病毒口服液组、病毒对照组。除正常组外其它各组腹腔接种柯萨奇病毒B组3型（CVB3）建立VMC模型，药物治疗组均灌胃给药，0.2 ml/10g，2次/d。给药10 d后，应用ELISA 检测血清中TNF-α的浓度，同时应用RT-PCR观测心脏组织中细胞因子TNF-α mRNA表达情况。结果应用生黄合剂治疗VMC后，血清中TNF-α的浓度可显著降低，心脏组织中TNF-α mRNA表达显著下降。结论生黄合剂通过调节细胞因子TNF-α mRNA的水平来发挥其对VMC有益的免疫调节作用。
       【关键词】  病毒性心肌炎； 黄芩茎叶总黄酮； 肿瘤坏死因子； 细胞因子； 免疫调节
       病毒性心肌炎（VMC）的主要发病机制是病毒直接损伤作用和机体的免疫反应作用。许多学者认为在VMC的发病过程中，早期的发病机理和病毒的直接损伤有关，而急性期和机体免疫损伤有关。许多研究表明细胞因子尤其是TNF与VMC密切相关。为此，我们观察了生脉饮与黄芩茎叶总黄酮联用（以下简称生黄合剂）对VMC小鼠细胞因子尤其是肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的影响，旨在探讨生黄合剂对VMC的免疫调节机制。
       1  材料
          
       萨奇病毒B组Nancy 株（承德医学院中药研究所惠赠）。在Hele细胞上扩增后半数组织感染量（TCID50）为10-5.8。雄性Balb/c小鼠，170只，［体质量16～18g，北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号: SCXX（京）2002-2003］。总黄酮：（黄芩茎叶大孔吸附树脂提取物，承德医学院中药研究所提供）；生脉饮（北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂，国药准字：Z11020363）；抗病毒口服液（河南慷鑫药业有限公司，国药准字：Z41022199）。TNF-α:ELISA试剂盒（美国Biosouce公司）TRIZOL Reagent 、M-MLVReverse Transcriptase（Invitrogen）。Pfu DNA polymerase（北京天为时代科技有限公司）。引物β-actin:上游5">CCC CAA GGC CAA CCG TGA A<3"，下游5">CGG AAT CGC TCG TTG CCA AT GT<3"，扩增产物为435bp; TNF-α:上游5"> TGT CTA CTC CCA GGT TCT C <3"，下游5"> CCC ATT CCC TTCACAGAGC <3"，扩增产物为311 bp由天津灏洋公司设计，上海生工合成。
       2  方法
       2.1  VMC模型制作体质量16～18 g的雄性Balb/c小鼠，随机分为生黄合剂治疗组（包括AⅠ组即生黄合剂高剂量组，AⅡ组即生黄合剂低剂量组），生脉饮组（B组），抗病毒口服液组（C组），病毒对照组（D组），每组30只。每组腹腔注射800TCID50的CVB3 0.1ml，制作VMC模型。另取20只正常小鼠作为正常组（E组），不造模。
       2.2  治疗方法于接种病毒1 h后AⅠ组予总黄酮200 mg/kg，生脉饮10   ml/kg；AⅡ组予总黄酮50 mg/kg、生脉饮2.5 ml/kg；生脉饮组予10 ml/kg生脉饮和抗病毒口服液组予10 ml/kg抗病毒口服液，日两次灌胃。病毒对照组与正常组予等剂量的生理盐水灌胃。
       2.3  检测方法连续给药10 d，每组随机取10只小鼠，常规无菌取血后，颈椎脱位处死小鼠，摘取心脏，心底部用光镜观察心肌细胞损伤情况并计算心肌病理积分。用双抗体夹心ELISA法测定小鼠血清TNF-α水平。心尖部心脏组织采用RT-PCR方法，测定细胞因子TNF-α mRNA表达情况。应用Trizol核酸提取试剂一步法提取心脏组织总RNA，RT严格按照试剂盒说明书操作，分别扩增28、22循环， PCR产物予1%的琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像及分析系统分析各DNA条带灰度值,做半定量分析。
       2.4  统计学方法采用SPSS11.0统计软件，结果均以  ±s表示，行t检验。检验水准α=0.05。
       3  结果
          
       动物的一般情况  接种CVB3后第3天，病毒对照组部分小鼠出现明显的活动减少，精神萎靡，毛无光泽，蜷缩，对刺激反应迟钝，进食、水减少，第5天开始死亡，死亡高峰主要集中在接种病毒后8～10 d，10 d死亡14只。治疗组死亡时间推迟到第6天，AⅠ组第9天开始死亡，10 d共死亡3只。AⅡ组死亡10只，生脉饮组死亡10只，抗病毒口服液组死亡12只，正常组小鼠无一例死亡。
       3.1  小鼠心肌细胞的损伤情况
       除正常组外，其它各实验组小鼠在感染CVB3后均出现不同程度的VMC的表现。其中D组小鼠心肌病变严重，心肌细胞大面积坏死并伴有大量的钙盐沉积。AⅠ组小鼠出现轻微改变，可见少量淋巴细胞或单核细胞浸润。AⅡ组心肌局灶性坏死，炎细胞浸润较多。生脉饮组病变可见小灶性坏死，少量炎细胞浸润。抗病毒口服液组可见大灶性坏死及炎细胞浸润，见图1～3。各组小鼠心肌细胞病变积分见表1。
       3.2  小鼠血清中TNF-α水平见表1。
       3.3  RT-PCR结果 见图4。
       3.4  各组小鼠血清中细胞因子TNF-α及心脏组织细胞因子TNF-α mRNA的半定量结果见表1。表1  各组小鼠染毒10天心肌病变积分、TNF-α及TNF-α mRNA 的结果分析(略)
       4  讨论
           　
       目前认为病毒性心肌炎的发生与机体免疫功能失控有关，许多学者认为细胞因子参与的免疫反应在病毒性心肌炎发病中起重要作用。TNF - α是一种具有广谱生理和病理效应的可溶性多肽,主要由单核巨噬细胞产生 ,具有多项生物学效应 ,既是天然免疫和特异性免疫的重要介质，又是联系特异性免疫和炎症反应的重要因子之一。低浓度的 TNF -α是防御病原微生物的重要因素，若浓度过高，则可引起一些炎性损害 。TNF -α还可增强白细胞与血管内皮黏附的作用，可促进炎性细胞的渗出与趋化 ,激活炎性细胞是一种具有强烈致炎活性的炎症介质，许多研究表明在VMC急性期TNF- α参与了心肌炎的形成［1］。本研究结果表明病毒对照组TNF -α显著高于正常对照组，与文献报道一致，病毒对照组心肌中TNF-α mRNA高于正常组，进一步说明TNF-α参与心肌炎的形成。VMC目前尚缺乏特效的治疗方法，近年来许多基础与临床研究证实了中药对VMC的治疗效果。文献表明，生脉饮具有广泛的免疫药理活性，能增强并调节机体的免疫功能，具有较强的抗炎、抗氧自由基和抗脂质过氧化作用［2］。生脉饮治疗急性VMC可使患者临床症状明显减轻，具有较好的临床效果［3］。黄芩茎叶提取物总黄酮的主要化学成分为野黄芩苷，具有调节机体免疫功能、抗炎作用，对已感染CVB3的Hela细胞具有明显的保护作用［4］。有研究显示黄芩茎叶总黄酮与生脉饮具有交互作用，两者联用能明显减轻CVB3感染细胞的损伤，抑制细胞病变［5］。黄芩茎叶总黄酮与生脉饮联用还可降低血清中细胞因子IL-2水平，提高细胞因子IL-10的浓度，通过调节Th1/ Th2网络平衡对CVB3感染小鼠起到一定的治疗作用［6］。
       
       本实验用ELISA法和半定量PCR方法检测VMC小鼠血清中TNF-α的水平和心脏组织中的细胞因子TNF-α mRNA的表达情况,结果显示了生黄合剂的高、低配方均可显著的降低血清中TNF-α并抑制TNF-α mRNA的表达，且高剂量配方对VMC的免疫调节作用最好，说明两者的治疗效果存在剂量依赖关系，本实验提示生黄合剂对TNF-α的调节作用,尤其是从分子水平的调节作用可能是其治疗VMC的重要机制之一。
       【参考文献】
         　［1］朱春霞，张寄南，杨明智，等.病毒性心肌炎、扩张型心肌病患者TNF、sIL-2R、IL-6、IL-8、T细胞亚群的改变［J］.江苏临床医学杂志，2001，5：378.
       
       ［2］季宇彬.中药复方化学与药理［M］.北京：人民卫生出版社，2003：300.
       
       ［3］许之民，赵美华，陆秋芬，等. 生脉散对急性病毒性心肌炎临床症状及炎症损伤指标的影响［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2003，1（2）：86.
       
       ［4］张凤英，宋鸿儒，赵连志，等. 生脉饮与黄芩茎叶总黄酮对CVB3感染细胞的保护作用［J］.山东医药，2006，46（23）：25.
       
       ［5］张凤英，周晓春，刘玉玲，等.黄芩茎叶总黄酮与生脉饮对小鼠病毒性心肌炎的疗效研究［J］.山东医药，2005，45（23）：20.
       
       ［6］高玉峰，李素婷，段一娜，等 . 生黄合剂对病毒性心肌炎小鼠血清IL-2及IL-10的影响［J］.时珍国医国药，2007，18(2)：424.