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       【摘要】 
       目的观察松果菊苷（ECH）对大鼠脑缺血损伤海马区神经细胞凋亡的影响。方法雄性SD大鼠，随机分为假手术组、模型组、川芎嗪组、ECH大剂量组、ECH小剂量组。采用大鼠大脑中动脉线栓法（MCAO）建立局灶性脑缺血损伤模型，各组造模后24 h处死，取脑。应用HE染色法观察脑组织病理改变，脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记（TUNEL）法观察大鼠脑缺血后海马区神经细胞凋亡。结果脑缺血后，海马区神经细胞正常组织结构消失、胞核碎裂、溶解坏死等形态学改变，凋亡神经细胞数量明显增加；与模型组比较，川芎嗪组、ECH大剂量组和ECH小剂量组海马区凋亡神经细胞表达数量均有不同程度的减少。结论ECH对脑缺血大鼠脑组织具有保护作用，其机制可能与抗细胞凋亡作用有关。
       【关键词】  松果菊苷； 脑缺血； 细胞凋亡
          近年来脑缺血损伤与神经元死亡的关系受到广泛关注，而细胞凋亡是神经元死亡的主要方式，研究发现在缺血损伤、兴奋毒性引起的脑损伤中，神经元凋亡明显增加。脑损伤中神经元的凋亡及其发生机制现已成为广泛研究的重点。本文采用大鼠脑缺血模型，观察松果菊苷（Echinacoside,ECH）对脑缺血损伤的保护作用。
       1  材料与方法
       1.1  药品与试剂ECH由北京大学药学院屠鹏飞教授惠赠（纯度95%以上），注射用盐酸川芎嗪（哈尔滨三联药业有限公司），红四氯唑（中国华东师范大学化工厂），水合氯醛（天津市福晨化学试剂厂），多聚甲醛（天津市化学试剂研究所），细胞凋亡试剂盒（购自Promega公司），市售鱼线（直径0.26 mm）。
       1.2  动物分组及模型制备雄性SD大鼠共50只，体质量250～300 g，购自新疆实验动物研究中心（合格证号：2009-0053）,随机分为5组：①假手术组：生理盐水1 ml·kg-1·d-1×7 d；②模型组：生理盐水1 ml·kg-1·d-1×7 d；③脑缺血+阳性药物对照组：盐酸川芎嗪50 ml·kg-1·d-1×7 d；④脑缺血+ECH大剂量组：ECH 50 mg·kg-1·d-1×7 d；⑤脑缺血+ECH小剂量组：ECH 25 mg·kg-1·d-1×7 d。各组动物每天连续腹腔注射给药7 d，于末次给药1 h后,清醒状态下用10%水合氯醛（3.0～3.5 ml·kg-1）麻醉，采用Longa等［1］提出的改良线栓法法制作大鼠左侧大脑局灶性脑缺血模型(MCAO模型)。假手术组只是鱼线插入仅10 mm，其余步骤同手术组。
       1.3  神经功能缺失体征评分按文献［2］的5分制法进行评分。0分：无神经损伤症状；1分：不能完全伸展对侧前爪；2分：向对侧转圈；3分：向对侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。1～3分为造模成功动物。0分、4分或死亡剔除，再随机补充。
       1.4   TTC染色动物麻醉，取脑-20℃冰箱中速冻20 min，冠状位每隔2 mm切片（5片）。切片置于2%TTC液中，避光放入37℃水浴锅中孵育30 min，4%多聚甲醛固定保存。
       1.5  HE染色动物手术后24 h，按文献操作［3］，麻醉，打开胸腔暴露心脏，灌注针插入心尖并剪开右心耳，经左心室插入升主动脉，快速生理盐水灌注至肝脏变白，再持续灌注4%多聚甲醛30 min，至大鼠四肢僵硬。完毕后取脑于上述固定液中4℃固定48 h，常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋制成石蜡切块，在视交叉前后1 mm范围切片，连续冠状切片，切片厚5 μm，HE染色后光镜下观察。
       1.6  细胞凋亡采用TUNEL［4］法，按细胞凋亡原位检测试剂盒说明书标记凋亡细胞。具体步骤如下：脑组织切片常规石蜡脱水，滴加TUNEL反应混合物，37℃孵育60 min，滴加转化剂-POD（辣根过氧化酶标记），室温放置15 min，期间用磷酸缓冲液PBS冲洗样本3次，再滴加100 μl的1，2-二甲基苯胺（DAB）底物溶液，室温孵育5～20 min，镜下出现浅棕色背景时，终止反应，苏木素复染。脱水，透明，中性树胶封片，光镜下观察并拍照。
       2  结果
       2.1  脑片TTC染色缺血后缺血侧鼠脑肿胀，有明显的梗死灶形成，TTC染色显示正常脑组织呈红色，梗死灶脑组织呈苍白色；所有评分在1～3分大鼠的脑片经TTC染色后均有苍白色梗死灶出现（图1），表明模型的制作是成功的。
       2.2  HE染色假手术组可见神经细胞形态完整，排列紧密，胞核完整，核仁清晰，细胞周围间隙无水肿；模型组神经细胞肿胀，多数细胞核固缩，核仁欠清晰。缺血中心区神经细胞正常组织结构消失、胞核碎裂、溶解等坏色形态学改变，坏死灶边缘可见炎性细胞浸润；与模型组比较，川芎嗪组、ECH高、低剂量组神经元细胞数量均有增多，坏死灶周围胶质细胞增生，其中，川芎嗪组合ECH高剂量组肿胀的神经细胞明显减少，胞浆丰富，排列整齐，间质细胞增生，可见形态接近正常的神经元细胞（图2）。
       2.3  细胞凋亡  TUNEL染色光学显微镜下观察（图3）：阳性染色位于细胞胞核，呈棕黄色，正常细胞染色位于胞核，呈蓝色。①假手术组偶见细胞着棕色，细胞结构尚好；②模型组出现最为显著的神经元凋亡，表现为整个细胞皱缩，体积缩小，核固缩；③与假手术组相比，模型组海马区细胞凋亡数量明显增加；④与模型组比较，川芎嗪组、ECH大剂量组和ECH小剂量组海马区凋亡神经细胞表达数量均有不同程度的减少。
       实验结果表明，假手术可见散在分布少量的凋亡细胞，表明正常神经细胞存在细胞凋亡。各组药物均显示明显抑制细胞凋亡的作用，与模型组比较具有显著差异。不同剂量的ECH给药均能明显减轻脑缺血后神经细胞凋亡，具有不同程度的脑保护作用，且随ECH给药剂量的增加细胞凋亡数量进一步减少。通过本实验，证实ECH对脑缺血大鼠具有较好的保护作用，缺血预处理后可明显减轻细胞凋亡数量。
       3  讨论
         细胞凋亡是指在一定的生理或病理条件下，细胞启动自身基因调控机制，引起细胞自杀性死亡。其形态学特征为：细胞皱缩，不能与周围细胞接触，胞浆浓缩，胞体出现泡状，胞核裂解成凋亡小体，可被周围临近细胞吞噬。大量资料证明，脑缺血后脑损伤的病理变化为缺血中心区以坏死为主，半暗带区以凋亡为主。坏死是不可逆的死亡过程，而凋亡是可逆的过程，所以在缺血损伤中神经元凋亡扮演了重要角色，对凋亡机制的研究具有重要意义。目前国内外的研究均认为缺血后神经细胞凋亡主要是通过Caspase依赖途径和非Caspase依赖途径实现的，其中Caspase-3和AIF分别是这两种途径中的起作用的关键物质。凋亡诱导因子（AIF）是近年来发现的一种凋亡效应分子，正常情况下，AIF是一种定位于细胞线粒体膜间隙中的黄素蛋白，当有凋亡信号刺激时AIF分子从线粒体释放到细胞浆，再通过其核定位信号转位到细胞核中，直接引起染色体凝集和DNA呈大片段（～50 kb）断裂，导致细胞凋亡［5, 6］。
        ECH是苯乙醇苷类化合物，为管花肉苁蓉中的主要有效成分。近年研究表明，ECH 具有抗SH-SY5Y神经元凋亡［7，8］、抗衰老［9］、改善学习记忆［10］等神经保护作用。有研究表明，ECH可有效减少自由基的生成，抑制氧化应激反应的发生，进而产生明显的抗氧化作用，对神经元凋亡具有预防作用［11］。本实验通过采用大鼠大脑中动脉梗塞模型，观察到ECH预处理后，脑缺血大鼠凋亡细胞明显减少，初步阐明了ECH对脑缺血大鼠神经元的保护作用，为抗脑缺血药物的实验研究和临床应用研究提供了新的证据。
       【参考文献】
         　［1］Longa EZ, Weins tein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］. Stroke，1989，20(1):84.
       
       ［2］Koizumi J ，Yoshida Y，Nakazawa T, et al. Experimental studies of ischemic brain edema a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be induced in the ischemic area ［J］. Stroke，1986，8 (1):128.
       
       ［3］孙异临，盛树力，曲保清，等.实验性脑老化动物模型海马区的超微结构研究［J］.中国医学影像学杂志，2001，9(2):122.
       
       ［4］Agarwala，S. and Kalil，R.E. Axotomy-induced neuronal death and reactive astrogliosis in the lateral geniculate nucleus following a lesion of the visual cortex in the rat ［J］. Comp. Neurol，1998：392，252.
       
       ［5］I. Ferrer，B.Friguls，E.Dalfo，C. et al. Caspase-dependent and Caspase-independent signaling of apoptosis in the penumbra following middle cerebral artery occlusion in the adult rat［J］. Neuropathology and Applied Neurobiology，2003，29: 472.
       
       ［6］Joza N，Susin SA，Daugas E，et al. Essential role of the mitochondrial poptosis-inducing factor in programmed cell death［J］. Nature，2001，410(6828): 549.
       
       ［7］邓 敏，赵金恒，屠鹏飞，等.松果菊苷对TNFα诱导的 SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用［J］.中国药理学通报，2005，21(2):169.
       
       ［8］Deng M，Zhao J Y，Tu P F，et al. Echinacoside rescues the SHSY5Y neuronal cells from TNF α-induced apoptosis ［J］. Eur J Pharmacol，2004，505(1):11.
       
       ［9］Muteliefu G，Lei L，Tu P F，et al . Study on molecular mechanism of echinacoside for against aging［J］. Biophys Acta，2004，23(3):183.
       
       ［10］田 枫，张 阔，康爱君，等.松果菊苷改善SAM-P/8小鼠学习记忆能力作用机制初探 ［J］.实验动物科学与管理，2006，23(2):14.
       
       ［11］Deng M，Zhao J H，Tu P F，et al. Echinacoside protects the SHSY5Y neuronal cells from TNFα-induced apoptosis［J］.Chin Pharmacol Bull，2005，21(2): 169.