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       【摘要】 
       目的建立从沙苑子中制备沙苑子苷A对照品的方法。方法采用大孔树脂富集、聚酰胺柱色谱、硅胶柱色谱和重结晶方法对沙苑子80％乙醇提取物进行分离纯化，通过MS、IR、UV、1H-NMR和13C-NMR进行结构鉴定，通过TLC和HPLC对对照品进行纯度检测。结果从沙苑子中分离、纯化出沙苑子苷A对照品，质量分数>99.0％。结论该方法制备的沙苑子苷A对照品符合中药化学对照品的相关要求，可作为沙苑子药材及其制剂质量控制，以及中药药效物质基础研究用的化学对照品。
       【关键词】  沙苑子； 沙苑子苷A； 对照品
       沙苑子为豆科植物扁茎黄芪Astragalus complanatus R.Br.干燥成熟的种子［1］，能温补肝肾、固精、缩尿、明目，用于治疗肾虚腰痛，遗精早泄，白浊带下，小便余沥，眩晕目昏；始载于《图经本草》，名为白蒺藜。
       
       沙苑子主要含有黄酮类、三萜类、有机酸类、氨基酸等。黄酮类成分是沙苑子的主要有效成分，具有许多药理活性。近年来研究认为沙苑子总黄酮可保护大鼠重要器官免受运动损伤，明显提高大鼠的运动能力［2］，抑制肝纤维化形成［3］，抗肿瘤［4～6］，此外对SHR和RHR［7～8］有明显的降压作用。但有关沙苑子的质量标准中，由于缺少化学对照品，尚无沙苑子黄酮含量控制指标，2005年版的《中国药典》中沙苑子的质量标准也仅有性状、显微、荧光检测等内容。为了进一步研究和完善沙苑子的质量标准，迫切需要研制一种或多种对照品。沙苑子苷A是沙苑子黄酮的主要特征性成分，且在沙苑子中的含量较高，也是沙苑子保肝抗肝纤维化的主要有效成分之一。本文从沙苑子中提取、分离和纯化沙苑子苷A，制备沙苑子苷A对照品，为制定和完善沙苑子及其制剂的质量标准提供沙苑子苷A对照品。
       1  仪器与材料
          
       美国Nicolet公司FT-IR Magna-550红外光谱仪 (KBr压片)；美国VARIAN公司INVOA-400超导核磁共振谱仪核磁共振仪；美国ABI Qtrap2000液相色谱－质谱仪；英国MICROMASS GCT OA-TOF高分辨质谱仪；惠普7530-GUV/VIS紫外光谱仪；岛津LC-20A高效液相色谱议，SPD-M20A二极管阵列检测器，岛津1.22 SP1色谱工作站；WC-1，显微熔点测定仪。
       
       沙苑子A complatus R.Br.苏州雷允上药业集团公司提供, 产地为陕西渭南，由苏州大学刘春宇教授鉴定为豆科植物扁茎黄芪Astragalus complanatus R.Br.的种子；黄酮吸附树脂ZTC-5型（天津正天澄清技术有限公司）；聚酰胺（100-200目，浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂）；聚酰胺薄膜（浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂）；硅胶（青岛海洋化工厂），其它化学试剂均为分析纯。
       2  方法与结果
       2.1  沙苑子苷A的制备工艺取沙苑子粗粉3 kg，用10倍量石油醚回流脱脂，脱脂药粉挥干，用10倍量的80%乙醇提取2次，1.5 h/次,过滤，合并滤液，回收溶剂后，加水稀释至3 000 ml，通过ZTC-5黄酮大孔吸附树脂，依次用水及50%乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱部位，回收溶剂，干燥，即为沙苑子总黄酮（40 g）。取总黄酮加水溶解，过滤，经聚酰胺柱层析，用水及不同浓度乙醇梯度洗脱，收集水洗脱部位，上硅胶柱，用醋酸乙酯∶甲醇梯度洗脱，醋酸乙酯∶甲醇(10∶2)洗脱部位析出沙苑子苷A结晶，甲醇进行多次重结晶，得淡黄色针状结晶（700 mg）。
       2.2  对照品的理化性质及结构鉴定结晶经显微熔点测定仪测定，mp279～280℃（未校正），盐酸－镁粉反应呈樱红色；酸水解后溶液遇斐林试剂呈阳性反应，三氯化铝反应呈黄色；氧氯化锆－枸缘酸反应鲜黄色消退，说明有5位羟基无3位游离羟基。提示为黄酮苷类化合物。光谱分析结果如下：UV（nm）MeoH：266.2，333.8；IRKBRMAX  3 371.8（γOH），1 655.0（γC＝O），1 597.2，1 500.7（Ar）：1 253.8(Ar-O-C),1 076.4,1 022(C-O)；EI-MS m/e :(苷元)300（M－162＋H），271，121；Mariner Mass (m/2)625.18 (M＋624+1);463.12(M＋-162+H);274.27;206.99说明该化合物含两个六碳糖。13C-NMR: （见表1）。1H-NMR:12.569(1H,s,5-OH),8.169 (2H,d,J=9 Hz,2′,6′-H,7.16(2H, d,J=9 Hz, 3′,5′-H),6.80(1H,d,J=1 Hz,8-H),6.41(1H,d,J=1 Hz,6-H),5.50(1H, d, J=7 Hz, glc1″-H),5.39(1H,d,J=7 Hz,glc1″′ -H),3.87(3H, s,7-OCH3)。根据以上数据分析，与文献［2］报道的沙苑子苷A一致。见表1及图1～3。表1  沙苑子苷AC-NMR数据（略）
       2.3  对照品的纯度检测
       2.3.1  对照品的杂质检查
       
       薄层色谱法检查：取适量沙苑子苷A对照品，50%乙醇制成1 mg/ml的溶液，以醋酸乙酯∶醋酸∶水（10∶2∶2  上层液）和氯仿∶甲醇∶水（6.5∶3.5∶1）为展开剂，点样量5，10，20 μl，在硅胶G板上进行展开，以1%AlCl3乙醇溶液为显色剂，分别在365 nm紫外灯和日光下观察。另于聚酰胺薄膜上，以丙酮∶水（1∶2）进行展开，1%AlCl3乙醇溶液为显色剂，在365nm紫外灯下观察。结果表明，在3种展开剂中对照品均为一个黄绿色斑点，未见杂质斑点。比移值Rf分别为：0.31，0.82，0.36。
       高效液相色谱检测：色谱柱VP-ODS（150 mm×4.6 mm,5 μm）；分别以乙腈∶1%乙酸（22∶78），（16∶84），（14∶86）为流动相；流速：1 ml/min；柱温：40℃；检测波长：266 nm，对照品溶液质量浓度为0.1 mg/ml,进样量20 μl。结果表明，在3种流动相下对照品均为一个主峰，保留时间分别为:7.45,16.71，28.46 min。改变流动相分析时未出现异常峰。
       2.3.2  面积归一化法纯度检查色谱柱VP-ODS（150 mm×4.6 mm,5 μm）；分别以乙腈∶1%乙酸（22∶78）,（16∶84），（14∶86）为流动相；流速：1 ml/min；柱温：40℃；检测波长：266 nm，取0.1 mg/ml的溶液进样量20 μl。采集时间比保留时间延长1倍以上，检测结果经峰面积归一化法计算，质量分数为99.2％，99.4％，99.0％。RP-HPLC色谱图见图4。
       2.3.3  二极管阵列检测器(PDA)纯度检查在“2．3．1”项中色谱条件下，200～800 nm用PDA检测器记录色谱图，检查主成分峰的纯度（见图5）。测定结果表明，主成分峰的纯度因子为999.834；五点光谱图完全重合，表明主成分峰为单一物质峰。
       3  讨论
          
       实验中我们采用石油醚脱脂，80％乙醇提取，ZTC－5黄酮大孔吸附树脂富集，提取的总黄酮得率高，杂项相对较少，选择聚酰胺柱层析、硅胶柱层析、重结晶等方法分离纯化沙苑子苷A对照品，方法简便，纯度达98％以上，符合《新药审批办法》对中药对照品的规定，为制定和完善沙苑子及其制剂的质量标准提供了沙苑子苷A对照品。
       【参考文献】
         　［1］国家药典委员会.中国药典,Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，1995：155.
       
       ［2］刘宁,王轲,马兰军，等.沙苑子总黄酮对运动训练大鼠血液中某些生化指标影响的实验研究［J］.青海医学院学报,2006,27(2):81.
       
       ［3］刘春宇,顾振纶,张克平，等.沙苑子黄酮对DMN诱导的大鼠肝纤维化形成的影响［J］.中国药理学通报,2004,20（1）:110.
       
       ［4］刘春宇，顾振纶，杜崇民，等.沙苑子黄酮抗裸鼠人肝癌移植瘤的实验研究［J］.中国药理学通报，2007，23（6）：781.
       
       ［5］刘春宇，顾振纶，杜崇民，等. 沙苑子抗肿瘤活性成分体内外筛选［J］.中草药，2007，38（7）：1052.
       
       ［6］刘春宇，顾振纶,杜崇民，等. 沙苑子黄酮对H22荷瘤小鼠的肿瘤抑制作用及对免疫功能的影响［J］.中成药，2007，29（11）：1690.
       
       ［7］薛冰，李景新，陈连璧.沙苑子总黄酮对SHR的降压及血流动力学影响［J］.中国中药杂志，2002,27（11）：855.
       
       ［8］李景新,薛冰,陈连壁.沙苑子总黄酮对高血压大鼠的降压作用及血管紧张素含量的影响［J］.中国药理学与毒理学杂志,2002,16（5）:336.