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       【摘要】 
       目的建立并优化蒲公英样品总DNA提取方法及其RAPD-PCR反应体系。方法采用改良的CTAB法提取基因组DNA，对蒲公英RAPD-PCR反应体系中各个主要影响因子进行了优化和筛选。结果建立了多态性高、重复性好、可用于蒲公英RAPD分析的最佳反应体系。25 μl反应体系中含有：1×Taq Mix buffer，50 ng DNA模板，0.4 μmol/L 引物，1.5 mmol/L Mg2+，0.25 mmol/L dNTPs，1.25U Taq酶。扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，38℃复性1 min，72℃延伸2 min，共40个循环；72℃延伸10 min，反应结束后，4℃保存。结论这一优化体系的建立为今后利用RAPD标记技术进行蒲公英鉴定及种质资源遗传多样性分析奠定了基础。
       【关键词】  蒲公英； 基因组DNA提取； 随机扩增多态性DNA技术
       蒲公英为菊科植物蒲公英Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.，碱地蒲公英Taraxacum sinicum  Kitag.或同属数种植物的干燥全草，具有清热解毒、消肿散结、利尿通淋之功效，主要用于乳痈、肺痈、肠痈、痄腮、咽痛、湿热黄疸、热淋涩痛等症［1］。蒲公英品种繁多，资源丰富且来源复杂，目前对其鉴别一直沿用经典的性状鉴定、显微鉴定及理化鉴定等方法。而这些方法的鉴定标识建立在个体形态和客观观测水平上，在生物学上为物种的遗传表现型，受到遗传因素、生物体的生长发育阶段、环境条件、人类活动如引种驯化、加工炮制等影响，具有很大的变异性，存在主观性强、重复性和稳定性差等缺点。
       
       随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphism DNA，RAPD）技术是由美国杜邦公司的科学家Williams JGK和加利福尼亚生物研究所Welsh J领导的两个研究小组在1990 年同时推出的，该技术根据PCR 原理，以随机设计的寡核苷酸引物扩增DNA中的一些片段。短短几年，此方法已成功地应用于遗传多样性检测［2］、基因定位、品系鉴定［3］、遗传图谱构建和系统学研究等诸多领域。但RAPD扩增易受多种因素的影响，如模板DNA浓度、引物浓度及Taq酶浓度等，扩增条件的变化会对RAPD图谱产生较大的影响，从而影响RAPD分析的准确性和稳定性，因此为了获得重复性和可靠性高的RAPD图谱，对蒲公英进行PCR扩增条件的优化和引物退火温度的确定十分必要。本研究探讨了蒲公英RAPD-PCR反应的优化条件，以期建立可用于蒲公英RAPD-PCR分析的最佳反应体系和扩增程序，为深入开展蒲公英鉴定及种质资源遗传多样性分析奠定基础。
       1  材料与仪器
       1.1  材料
       蒲公英叶片于2009-04采自河南中牟、邙山、济源、开封等地，经本院生药学科董诚明教授鉴定为菊科植物蒲公英，用变色硅胶将其叶片快速干燥后置于-20℃冰箱备用。
       1.2  试剂CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)：上海山浦化工有限公司；Tris(三羟甲基氨基甲烷)：美国Sigma公司；EDTA(乙二胺四乙酸二钠盐)：美国Amresco公司； DL 15 000 bp、DL 2 000 bp DNA Marker：大连TaKaRa公司；2×Taq PCR Master Mix：北京TIANGEN公司；10 mer随机引物：上海英骏生物技术有限公司合成；其余化学试剂均为国产分析纯。
       1.3  仪器
       DYY-6C型电泳仪：北京市六一仪器厂； Gel Doc 2000TM型凝胶图像分析仪：美国BIO-RAD公司；梯度PCR仪：德国Biometra公司；GR22G型高速低温离心机：日本日立公司；微量移液器：德国eppendorf公司。
       2  方法
       2.1  蒲公英叶基因组总DNA的提取和检测  在经典的CTAB法的基础上加以改良：称取0.5 g样品加入10%的PVP一起在冰上用玻璃砂在研钵中研磨，磨碎后转移至10 ml离心管中，加入10倍体积的冰预冷的洗涤缓冲液(250 mmol/L氯化钠，250 mmol/L Tris-HCl pH=8.0,50 mmol/L EDTA pH=8.0，5%PVP)，冰浴10 min，10 000 r/min离心5 min，弃上清液，再用洗涤缓冲液洗涤沉淀1次。加入1 ml 2×CTAB提取缓冲液(100 mmol/l Tris-HCl pH=8.0，20 mmol/L EDTA pH=8.0，1.4 mol/L氯化钠，2%CTAB，5%PVP)，100 μl β-巯基乙醇，65 ℃温育3 h，不时振摇。4 ℃12 000 r/min离心10 min，取上清液于另一离心管中，加入适量的RNase A酶，37 ℃温育45 min，加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提3次，4℃ 12 000 r/min离心10 min。取上清液分装于1.5 ml EP中，加入等体积预冷的异丙醇，混匀，于-20 ℃静置30 min或过夜，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，小心弃去上清液，用75%乙醇洗涤沉淀两次，4 ℃ 12 000 r/min离心5 min，在室温下干燥。将干燥的DNA沉淀溶解于100 μlTE缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl pH=8.0，1 mmol/L EDTA pH=8.0)中，4 ℃保存。经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析，Gel Doc 2000TM型凝胶图像分析系统拍照，于蛋白核酸测定仪上测定其原始浓度，最后统一稀释成终浓度20ng/μl，保存-20℃备用。
       2.2  RAPD-PCR初始扩增体系  参照常规的PCR反应中各组分的量及相关研究论文，确定蒲公英RAPD-PCR初始的反应体系为：反应总体积25 μl，内含1.2×Taq Mix buffer(镁离子1.8 mmol/L、Taq酶1.5 U、dNTPs 0.3 mmol/L)、模板DNA 50 ng、随机引物0.2 mmol/L。根据预试验的结果，以S36(AGCCA-GCGAA)为引物，对蒲公英RAPD反应体系中的5种主要反应成分分别进行单因素试验，每一个合适条件确定后作为后续研究的一个条件。
       
       扩增程序定为94℃预变性5 min；然后进行40个循环：94℃变性1 min，37℃复性1 min，72℃延伸1.5 min；循环后72℃延伸10 min；4℃保存。PCR扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶中电泳检测，电压5 V/cm，电泳结束后，在Gel Doc 2000TM型凝胶图像分析仪上观察并照相记录。
       2.3  退火温度的确定采用梯度PCR仪，设定退火温度最低31.0℃和最高43.0℃，扩增仪自动生成8个温度梯度，分别为：31.0，32.1，34.0，36.0，38.0，40.0，41.9，43.0℃。
       2.4  随机引物的筛选及RAPD优化体系的验证采用优化出的PCR反应体系对100条RAPD随机引物进行初步筛选，最终从中选出能够稳定扩增出条带清晰、多态性明显的引物。分别采用筛选出的不同随机引物应用优化好的PCR体系对其它样品个体进行RAPD扩增。
       3  结果
       3.1  蒲公英叶片基因组DNA的提取采用改良的CTAB法所提DNA为白色，经蛋白核酸测定仪检测，其平均OD260/280值为1.832，说明所提DNA无蛋白质和RNA污染，纯度较高。同时将所提的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示所得总DNA均有一条约15 kb清晰明亮的主带，无拖尾或弥散现象，完整性较好。结果见图1。
       3.2  蒲公英叶RAPD反应体系的优化
       3.2.1  模板浓度确定适宜的模板量是保证特异性扩增的前提，模板量过多会降低特异性效率，增加非特异性产物。本实验设置了10，20，40，50，60，80，100，120，140，160 ng共10个模板梯度，结果见图2，从中可以看出，DNA模板量在10～160 ng，扩增程度及扩增条带数无明显差异，浓度过高扩增条带较少或不稳定甚至无产物。因此，本研究将蒲公英扩增体系中模板加入量定为50 ng，扩增结果较好。
       3.2.2  引物浓度选择 引物浓度关系到扩增产物的质量，浓度太低不能进行有效的扩增，浓度太高会增加引物二聚体的形成，导致条带不稳定及清晰度下降。在优化其反应体系过程中设置了0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8 ，0.9，1.0  μmol/L共10个浓度水平。结果见图3，引物浓度为0.1 μmol/L时，扩增条带少而弱，0.2～0.5 μmol/L之间扩增条带数和亮度基本一致，引物浓度高于0.6 μmol/L时非特异性扩增条带增加。根据实验结果，本研究选择引物浓度为0.4 μmol/L。
       3.2.3  2×Taq PCR Master Mix Buffer用量选择  所用PCR buffer内含Mg2+，Taq DNA聚合酶，dNTPs三种成分，含量分别为：3.0 mmol/L Mg2+，0.1U/μl Taq酶、0.5 mmol/L dNTPs。Taq酶的种类以及使用量直接影响扩增反应的成功与否，dNTPs是PCR反应的原料，其用量与PCR产物产量直接相关。底物dNTPs浓度过高，会导致DNA聚合酶错误插入，背景模糊，浓度过低，又会影响合成效率，甚至会因dNTPs过早消耗而使产物单链化，影响扩增结果。为此，本研究对2×Taq PCR Master Mix Buffer用量共设置了5.0，7.5，10.0，12.5，15.0，17.5，20.0 μl共7个梯度。结果见图4。结果显示，加入量过少或过多都会造成扩增条带少而弱。本研究选择加入量为12.5 μl，即在25 μl 反应体系中，Mg2+浓度为1.5 mmol/L，dNTPs浓度为0.25 mmol/L，Taq酶1.25 U。
       3.3  引物退火温度的考察PCR反应中，退火温度的高低直接影响到引物与模板DNA的特异性结合。利用上面优化的最佳条件，针对引物的Tm值进行梯度退火实验。结果见图5。在36～40℃范围内，都能扩增出主要条带，但比较看出，在38℃扩增的条带清晰且稳定性高，为此，本研究选择38℃作为蒲公英RAPD反应的最适退火温度。
       
       通过对上述条件的优化，筛选出适合于蒲公英RAPD-PCR的反应体系，25μl的体系中含有：1×Taq PCR Master Mix Buffer(1.5 mmol/L Mg2+，0.25 mmol/L dNTPs，1.25 U Taq酶)，50 ng模板DNA和0.4 μmol/L引物。扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，38℃复性1 min，72℃延伸2 min，共40个循环；72℃延伸10 min，反应结束后，4℃保存。
       3.4  随机引物的初步筛选及RAPD优化反应体系的验证  经过大量的试验，最终选出了10条扩增出条带清晰、多态性明显的引物。引物及其序列见表2。利用筛选出的随机引物S36及优化的PCR反应体系对不同居群蒲公英样品DNA进行扩增，结果均获得了背景清晰、多态性高、稳定性好的DNA扩增片段，可用于蒲公英品种鉴别及遗传多样性分析，PCR扩增结果见图6。表2  筛选出的部分引物（略）
       4  讨论
          
       从蒲公英叶片中提取总DNA的关键是如何有效地去除多糖、生物碱及其它次生代谢产物。叶片在液氮中研磨是为了降低DNA酶的活性，防止DNA在溶出时发生降解。CTAB是一种去污剂，既能裂解细胞，又能有效沉淀多糖。在提取缓冲液中加入5%PVP和100 μl β-巯基乙醇也是为了防止多酚类物质的氧化、褐变。用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提能较好的除去蛋白质，经反复试验，抽提2～3次即可达到要求。同时为了除去可能残留在DNA沉淀中的无机盐及有机溶剂，采用75%的乙醇洗涤沉淀两次。结果表明，采用改良的CTAB法进行蒲公英叶基因组总DNA的提取，获得了高质量的DNA。
       
       Taq酶依赖于Mg2+，而Mg2+又受到dNTPs影响，dNTPs浓度过高则会与Taq酶竞争Mg2+，从而影响到Taq酶的活性。为了获得重复性和稳定性较好的RAPD谱带，提高分析的准确度，本研究对影响PCR的主要5种反应组分进行了反复试验，探索出了一套适合蒲公英RAPD扩增的优化条件，确定了蒲公英RAPD最佳反应体系，为进一步进行蒲公英遗传多样性RAPD分析研究奠定了坚实的基础。
       【参考文献】
         　［1］国家药典委员会.中国药典,Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社,2005:244.
       
       ［2］张春平,何平,胡世俊,等.药用金荞麦遗传多样性的RAPD分析［J］.中国中药杂志,2009,34(6):660.
       
       ［3］于艳丽,石俊英.RAPD技术在金银花品种鉴定中的应用［J］.中药材,2000,23(11):678.