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       【摘要】 
       目的首次合成未见报道的N，N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺，探讨其体内外抗肿瘤活性。方法①以芥酸和双(2-氯乙基)胺盐酸盐为原料、吡啶为催化剂合成N，N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺，分离纯化后核磁共振谱确证结构；②用N，N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺作用于Tca8113，用倒置显微镜镜下观察其对Tca8113细胞的生长状况的影响，PI染色经流式细胞术分析其杀伤效应；③S180小鼠动物肿瘤模型观察N，N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺对肿瘤的体内抑制作用。结果合成出了N，N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺并确证了其结构；N，N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺于体外0.15～10.0 μg/ml的浓度范围对Tca8113有较强的杀伤效应，杀伤率均超过30%，但与浓度递增无明显的正相关，在100.0 μg/ml以上的浓度反而杀伤效果不佳；体内抑制S180的生长，剂量为5 mg/kg时，抑制作用最好，生命延长率为38.20％，体重平均增长速率为2.45%。结论采用微型合成法能够快速、方便地合成出N，N－二
       【关键词】  芥酸； N，N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺； Tca8113； S180； 抗肿瘤作
       Synthesis of N，N-Di(2-chloroethyl) Erucamide and its Antitumor Activity in vitro and in vivo
       QIN Qing，GAO Mingxing, MO Dehuan, WANG Wenchu, LIN Hua，KUANG Xiaocong
        
       （School of Pharmacology, Guangxi Medical University, Nanning, 530021,China；School of Preclinical Medicine, Guangxi Medical University, Nanning 530021, China）
       Abstract：ObjectiveTo study the synthesis of the N,N-di(2-chloroethyl)erucamide and its activity of anti-tumor in vitro and vivo. Methods①Through the micro-organic synthesis technology, erucic acid was coupled with N,N-di(2-chloroethyl)amine hydro-chloride  as starting materials, pyridine as catalyst to synthesize the N,N-di(2-chloroethyl)erucamide. Isolation and purification were achieved by silical gel column chromatography, and its structure was confirmed by nuclear magnetic resonance spectrum.②Tca8113 was cultured in media with N,N-di(2-chloroethyl)erucamide,and the cell growth was observed through inverted microscope. The anti-tumor effect was detected by flow cytometry. ③Investigate the growth inhibitory for murine tumormodels in vivo.ResultsThe N,N-di(2-chloroethyl)erucamide was synthesized successfully and its strong killing effect was recorded within 0.15μg/ml～10.0μg/ml in vitro, and the rate was beyond 30%, but the effect had no positive correlation with concentration. The inhibitory concentration 50 % (IC50) was 0.135 38μg/ml . This compound had significant inhibitory effect on S180 growth in vivo. As dose was 5mg/kg, the inhibitory effect was the best, the life-prolonging rate was  38.20％,the average growth rate of body weight was 2.45%. ConclusionThrough the microscale organic synthesis, N,N-di(2-chloroethyl)erucamide can be synthesized quickly and conveniently. N,N-di(2-chloroethyl)erucamide has obvious anti-tumor effect in vitro and in vivo.
       Key words：  Erucic acid;   N,N-di(2-chloroethyl)erucamide;   Tca8113;  S180;  Anti- tumor
         
       为了研究药物的构效关系，我们需合成一系列的高级不饱和脂肪酸类似物，N，N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺是其中之一。本文选取芥酸为原料，采用经典的酰化反应，使用微型有机合成技术，首次合成出了目标产物。
       
       国内外学者从机制、临床意义等多方面对氮芥类药物抗肿瘤进行了大量的研究，目前临床上使用的氮芥类抗肿瘤药物有环磷酰胺、苯丁酸氮芥等［1］。而大多数抗肿瘤药物在有效剂量范围内的毒性比较大，有肾毒性、免疫抑制等不良反应。为了征服癌症，延长癌症病人的生存时间和提高生活质量，寻找低毒、高效、构效明确的抗肿瘤药物是目前肿瘤治疗中迫切需要解决的问题。
       
       在我们的前期工作中，已发现了具有免疫调节活性的板蓝根组酸（又名板蓝根高级不饱和脂肪酸）［2］，且其具有较好的体内外抗肿瘤活性［3～5］。为了研究板蓝根组酸的抗肿瘤定量构效关系，我们合成了一系列类似物并研究了其抗肿瘤活性［6～9］。我们还发现芥酸等高级脂肪酸具有较好的载体作用。
       
       我们进而以芥酸和双(2-氯乙基)胺盐酸盐为原料，采用经典的酰化反应，选择微型有机合成技术首次合成了N，N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺。我们还合成了一系列的板蓝根组酸类似物，期望经过结构改造，能合成新的活性药物及改善药物的通透性。
       1  材料与仪器
       1.1  试剂与仪器芥酸（由四川天宇油脂化学有限公司提供），氯化亚砜（AR，汕头西陇化工），双(2-氯乙基)胺盐酸盐（AR，保定加合精细化工有限公司），吡啶（AR，广东光华化学厂有限公司），四氢呋喃（AR，广东光华化学厂有限公司），二氯甲烷（AR，广东光华化学厂有限公司），醋酸乙酯（AR，广东汕头市西陇化工），石油醚（AR，广东光华化学厂有限公司），薄层层析用硅胶H（CP，青岛海洋化工有限公司），RPMI-1640培养基(HyClone公司)，胎牛血清(HyClone公司)，无水乙醇（AR，广东汕头市西陇化工）。
       1.2  仪器AE240双量程分析天平(METTLER-TOLEDO)，瑞士布鲁克AVANCE AV 500MHZ超导核磁共振谱仪，ML-902定时、恒温磁力搅拌器（上海浦江分析仪器厂），MERCK板，倒置显微镜(Leica,301-185.104-000)，Epics XL流式细胞仪（美国Coulter公司）。
       1.3  细胞株Tca8113细胞株（广西医科大学病理生理实验室提供），S180（购于中国科学院上海细胞库）。
       1.4  实验动物BALB/c小鼠，18～22 g，10只；KM小鼠，18～22 g，雌雄各半，共50只。由广西医科大学实验动物中心提供。
       
       2  方法与结果
       2.1  N，N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺的合成在 20ml微型二口烧瓶中加入芥酸11.8 mmol（4.0 g），加入氯化亚砜41.4 mmol（3.0 ml），吡啶两滴。磁力搅拌70°C反应4 h。抽干氯化亚砜，加入四氢呋喃6ml和双(2-氯乙基)胺盐酸盐16.8 mmol（3.0 g），室温反应12 h，至薄谱层析显示原料几乎完全转化时停止［10］。反应停止后，反应混合液加入pH 3～4的盐酸水溶液30 ml，振荡30 min，然后加入20 ml二氯甲烷，待混合物分成两相，弃上层；下层用pH 3～4的盐酸水溶液10 ml，洗涤两次，弃上层水洗液，干燥。
       反应方程式如下：
       CH3(CH2)7CH=CH(CH2)11COOH+SOCl2Pyridine70℃，4h
       CH3(CH2)7CH=CH(CH2)11COCl(ClCH2CH2)2NH·HClTHF，r.t.，12h
       CH3(CH2)7CH=CH(CH2)11CONCH2CH2ClCH2CH2Cl
       2.2  分离纯化取粗产物2.0 g，酸性氧化铝70 g，常压硅胶柱层析法，用石油醚－醋酸乙酯（99∶1）进行淋洗。分段收集，TLC法检测，合并相同流分，回收溶剂。分离得无色化合物0.50 g。
       
       产物以1H-NMR和13C-NMR进行结构鉴定。
       2.3  结构鉴定产物以1H-NMR和13C-NMR进行结构鉴定。
       1H-NMR（500MHz，CDCl3）δppm：5.36（2H，m，-CH=CH-），4.12（4H，s，-N-CH2-），3.58（4H，s，-N-C-CH2-），2.31（2H，t，-CH2-CON-），2.03（4H，m，-CH2-C=C-CH2-），1.62（2H，m，-CH2-C-CON-），1.30［24，m，-（CH2）n-］，0.88（3H，t，CH3-C-）。
       
       13C-NMR（500MHz，CDCl3）δppm：173.767，130.327，129.869，63.306，44.376，，34.308，31.900，29.769，29.655，29.593，29.536，29.515，29.456，29.308，29.251，29.196，29.158，27.206，26.129，24.979，22.664，22.7。
       
       根据反应物结构，综合以上光谱数据，鉴定该化合物为目标产物N，N-二(2-氯乙基) 芥酸酰胺。
       2.4  体外抗肿瘤作用的研究将对数生长期的Tca8113细胞以0.25%的胰蛋白酶消化，调整细胞浓度为1×105个/ml，置于12孔培养板， 1 ml/well，于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h。将不同浓度的样品加入不同的孔，配好的样品微乳液的浓度依次为500，300，200，100，50，10，5，1.5，0.5，0.15 μg/ml，阳性对照加入阿霉素，空白对照加等体积的10%胎牛血清的RPMI1640培养基，阴性对照加入与配药所用相同比例的溶剂和培养基，每个浓度做两个复孔。混匀，37℃、5%CO2培养箱中培养24 h，于倒置显微镜下观察细胞形态，收集所有细胞（包含上清液中漂浮的细胞），加入PI染液，室温、避光孵育30 min，流式细胞仪检测PI自发荧光强度以判断细胞死亡率。
       
       N，N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺作用于Tca8113细胞，在0.15～10.0 μg/ml的浓度范围有较强的杀伤效应，镜下观察细胞变圆，贴壁性能减弱，细胞上浮明显，细胞克隆生长状态受抑制，而且细胞收缩，折光度变差，未能保持上皮样生长方式，如图1～2所示。经流式细胞仪检测结果显示与上述一样，其在0.15～10.0 μg/ml的浓度范围有较强的杀伤效应，杀伤率均超过30%，但与浓度递增无明显的正相关，在100.0 μg/ml以上的浓度反而杀伤效果不佳。结果见表1。表1  化合物N，N－二(2-氯乙基)芥酸酰胺体外对TCA8113细胞杀伤效应(略)
       2.5  体内抗肿瘤作用的研究S180经细胞培养体外扩增，在BALB/c小鼠腹腔内传代，取第4代的腹水细胞，用0.9%氯化钠洗涤两次，将细胞浓度调整至1×108·ml-1，接种于KM鼠腹腔，0.2 ml/只。接种24 h后腹腔注射给药，N，N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺分高、中、低3个剂量（7.5，5，2.5 mg/kg），1次/d，连续给药，直到死亡。计算体重增加率、平均存活时间和生命延长率。实验中设阳性对照组（环磷酰胺10 mg/kg）及阴性对照组。
       
       实验结果表明，N，N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺对小鼠S180腹水瘤生长有一定的抑制作用，结果见表2。中剂量5 mg/kg时，其存活时间与阴性对照组和阳性对照组相比均有差异，且差异有统计学意义，P值分别为0.001和0.008；生命延长率为38.20％，与阳性对照组相比差异有统计学意义(P=0.008)；受试组体质量增加率也明显降低，中剂量组体质量平均增长速率为2.45%。表2  N，N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺对KM小鼠S180腹水瘤的抑制作用(略)
       3  讨论
          
       经核磁共振谱证实终化合物为目标产物，并且是一种新的化合物。
         
       在体外的抗肿瘤实验中，我们将N，N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺作用于Tca8113细胞，并进行了定性及定量观察。首先对癌细胞生长状态，包括细胞形态、生长方式的影响进行观察，然后经流式细胞仪作定量检测。结果表明，N，N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺对Tca8113细胞在较低浓度范围有明显的杀伤作用，在100.0 μg/ml以上的浓度反而杀伤效果不佳。在体内实验中，N，N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺5.0 mg/kg对S180腹水瘤有明显的抑制作用，能很大程度上延长小鼠的存活时间。体内外实验结果一致，此结果表明药物浓度递增与杀伤作用无明显的正相关。
       脂肪酸由于具有脂溶性大，能透过组织进入肿瘤细胞内和靶器官；其分子量较大，化学性质活泼，所以不仅能直接作为抑制肿瘤的药物，也能作为一种载体，携带药物进入到靶器官；也能经过结构改造，合成新的活性更强的药物。有研究报告［11,12］，由磷脂、胆固醇和油酸所组成的油酸多相脂质体（PL139）是与生物膜类似超微粒球状体，作为载体能携带药物进入细胞内，能提高巨噬细胞的吞噬功能。脂质过氧化产生的活性氧能提高肿瘤细胞对药物的敏感性［13］，产生的自由基和脂质过氧化物则可抑制肿瘤细胞的表达，缩短染色体的端粒，促进肿瘤细胞的凋亡［14］。氮芥类化合物能与DNA碱基共价结合而产生DNA的交叉联结,而主要与DNA分子大沟中(DNA major groove)的鸟嘌呤的N反应，使DNA分子因发生交叉联结而断裂，从而干扰DNA的复制或转录［15, 16］。N，N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺是一种脂肪酸，其杀伤肿瘤细胞的机理可能是以一种载体进入细胞内，使DNA结构和功能发生改变，阻止DNA复制，造成细胞DNA损伤，杀伤肿瘤细胞。
         
       综上所述，N，N-(2-氯乙基)芥酸酰胺在体内外都具有很明显的抗肿瘤作用，不具有浓度依赖性，是肿瘤化疗极具潜力的药物，其抗肿瘤机制有待进一步深入研究，具有一定的实际应用意义。
         
       致谢：本研究受到广西大型仪器协作共用网资助。
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