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       【摘要】 
       目的比较野生与栽培掌叶大黄中蒽醌类成分含量的差异。方法采用高效液相色谱法测定不同产地野生与栽培掌叶大黄中蒽醌类成分的含量，利用聚类分析对测定结果进行分类，通过相关分析研究海拔对掌叶大黄蒽醌类成分含量的影响。结果野生掌叶大黄中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量范围分别为0.29%～0.67%，0.47%～1.33%，0.25%～0.87%，0.55%～1.00%，0.06%～0.48%；栽培掌叶大黄中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量范围分别为0%～0.07%，0%～0.06%，0%～0.15%，0%～0.34%，0%～0.08%。聚类分析将野生掌叶大黄与栽培掌叶大黄明显地划为两类。相关分析结果表明，海拔高度对掌叶大黄蒽醌类成分含量有显著影响。结论野生掌叶大黄中蒽醌类成分的含量普遍高于栽培掌叶大黄。掌叶大黄中蒽醌类成分含量随海拔升高而升高。
       【关键词】  掌叶大黄； 栽培品和野生品； 蒽醌； 高效液相色谱法
       Comparison of the Contents of Anthraquinones Between Cultivated and Wild Rheum Palmatum
       LI Lei, SUN Ping, FENG Chengqiang
       (Beijing Area Major Laboratory of Protection and Utilization of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100875, China;Institute of Natural Medicine and Chinese Medicine Resources, College of Resource Science & Technology, Beijing Normal University, Beijing 100875,China)
       Abstract：ObjectiveTo do some comparative study on the contents of anthraquinones between the cultivated and wild samples of Rheum Palmatum. MethodsA reversed-phase HPLC method was established for the determination of contents of aloe-emodin，rhein，emodin，chrysophanol and physcion in cultivated and wild Rheum Palmatum from different regions. The classification was carried out by using the Hierarchical clustering analysis. The correlation analysis was used to study the effect of altitude on the contents of anthraquinones. ResultsThe content range of aloe-emodin，rhein，emodin，chrysophanol and physcion in wild Rheum Palmatum were 0.29％～0.67％，0.47％～1.33％，0.25％～0.87％，0.55％～1.00％，0.06％～0.48%, respectively. The content range of aloe-emodin，rhein，emodin，chrysophanol and physcion in cultivated Rheum Palmatum were 0～0.07％，0～0.06％，0～0.15％，0～0.34％，0～0.08％, respectively. According to the result of classification , all samples collected were divided into two grades the cultivated and the wild. The result of correlation analysis showed that the altitude had significant influence on the contents of anthraquinones in Rheum Palmatum. ConclusionThe contents of aloe-emodin，rhein，emodin，chrysophanol and physcion in the wild Rheum Palmatum are higher than those in the cultivated Rheum Palmatum. with the increase of altitude，the contents of anthraquinones show the tendency of increase.
       Key words：Rheum palmatum L．;  Cultivated and wild samples;  Anthraquinones;  HPLC
         
       掌叶大黄Rheum palmatum L．为蓼科大黄属多年生草本植物，以干燥根及根茎入药，是药典中大黄药材的主要来源之一，主要分布在甘肃、四川、青海、宁夏、西藏、陕西等地。大黄味苦，性寒，具有泻热通肠、凉血解毒、逐瘀通经的功效，其有效成分为蒽醌类化合物。由于大黄需求量很大，野生资源日渐减少，现已有多处进行人工栽培。本文参照《中国药典》（2OO5年版Ⅰ部）［1］所载HPLC法测定了栽培和野生掌叶大黄药材中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚5种蒽醌类成分的含量，并进行了比较研究，为开发利用掌叶大黄资源，确保人工栽培掌叶大黄的品质提供科学依据。
       1  仪器与试药
         
       Waters 2695高效液相色谱仪，Waters 2996二极管阵列检测器。甲醇为色谱纯，美国Fisher公司；水为娃哈哈纯净水；其余试剂均为分析纯。芦荟大黄素（批号110795-200605）、大黄酸（批号110757-200206）、大黄素（批号110756-200110）、大黄酚（批号110796-200615）和大黄素甲醚（批号110758-200610）对照品均购自中国药品生物制品检定所。栽培掌叶大黄（二年生）和野生掌叶大黄药材样品由冯成强副教授鉴定为掌叶大黄Rheum palmatum L．的干燥根。
       2  方法与结果
       2.1  对照品储备液的制备精密称取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚对照品各适量，用甲醇分别配制成浓度为109.6，76.0，106.2，155.7 μg·ml-1的对照品储备液，精密称取大黄素甲醚对照品适量，用甲醇－三氯甲烷（9∶1）的混合溶液配制成浓度为65.4 μg·ml-1的对照品储备液。
       2.2  供试品溶液的制备取掌叶大黄药材粉末(过40目筛)约0.15 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5 ml，置烧瓶中，挥去溶剂，加8%的盐酸溶液10 ml，超声处理2 min，再加三氯甲烷10 ml，加热回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 ml,合并三氯甲烷液，回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10 ml的容量瓶中，加甲醇置刻度，摇匀，经0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。
       2.3  色谱条件色谱柱为Diamonsil C18 (5 μm，4.6 mm×250 mm)；流动相为甲醇-0.1 %磷酸溶液（80∶20）；流速为1 ml·min-1；检测波长254 nm；柱温：30 ℃；进样量10 μl。在本色谱条件下，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚分离良好。色谱图见图1。
       2.4  线性关系考察精密量取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品储备液适量，采用倍比稀释法，分别用甲醇制成系列浓度的溶液，分别吸取上述系列溶液各10 μl，按上述色谱条件进行分析，测定峰面积。以峰面积(Y)为纵坐标，对照品浓度(X)为横坐标，进行线性回归，结果表明5个被测化合物在各自标准曲线范围内线性关系良好。回归方程分别为：芦荟大黄素Y=4.68×104X – 2.63×103，r=0.999 8；大黄酸Y=4.13×104X-3.70×103，r=0.999 8；大黄素Y=3.60×104X-2.89×103，r=0.999 8；大黄酚Y=5.29×104X+7.07×102，r=0.999 8；大黄素甲醚Y=3.45×104X–2.82×103，r=0.999 9。芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的线性范围分别是0.548～54.8，0.76～76.0，1.06～53.1，1.56～77.8，0.82～32.7 μg·ml-1。
       2.5  精密度实验取同一供试品溶液，在上述色谱条件下重复进样6次，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚峰面积的RSD分别0.91%，1.5%，0.83%，1.6%，1.8%。
       2.6  重复性实验精密称取同一大黄药材粉末6份，每份0.15 g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进行分析测定，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚含量的RSD分别为2.7%，2.6%，2.4%，2.7%，2.9%。
       2.7  稳定性实验取同一供试品溶液分别在0, 2，4，6，8，12 h进样分析，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚峰面积的RSD分别2.7%，1.6%，2.3%，1.4%，1.8%，说明供试品溶液在12 h内稳定。
       2.8  回收率实验精密称取已知含量的大黄粉末9份，每份0.075 g ，3份为一组，分别按相当于药材含量的80%，100%，120%，精密加入上述5个对照品储备溶液,按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进行分析测定，计算回收率。芦荟大黄素的平均回收率为97.2% (RSD＝2.1%)；大黄酸的平均回收率为97.1% (RSD=2.4%)；大黄素的平均回收率为98.2% (RSD=1.9%)；大黄酚的平均回收率为96.9% (RSD＝2.6%)；大黄素甲醚的平均回收率为96.4% (RSD=2.9%)。
       2.9  样品测定分别取不同产地栽培和野生掌叶大黄药材粉末，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10 μl，在上述色谱条件下进行分析测定，计算芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的含量,不同产地栽培和野生掌叶大黄中蒽醌类成分的含量测定结果见表1。从表中可以看出，各产地野生品中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的含量均高于栽培品。野生掌叶大黄的芦荟大黄素含量为0.29%～0.67%，大黄酸含量为0.47%～1.33%，大黄素含量为0.25%～0.87%，大黄酚含量为0.55%～1.00%，大黄素甲醚含量为0.06%～0.48%；栽培掌叶大黄的芦荟大黄素含量为0%～0.07%，大黄酸含量为0%～0.06%，大黄素含量为0%～0.15%，大黄酚含量为0%～0.34%，大黄素甲醚含量为0%～0.08%。药典规定5个蒽醌类成分的总量不得少于1.5%，本试验结果表明栽培品5个蒽醌类成分的总量在0%～0.65%之间，低于药典要求，而野生品5个蒽醌类成分的总量在1.78%～3.87%之间，均符合药典要求。表1  不同产地栽培和野生掌叶大黄蒽醌类成分的含量（略）
       2.10  聚类分析本研究以26个不同产地栽培和野生掌叶大黄样品为研究对象，对其所含的5个蒽醌类成分进行分析，获得5个色谱峰的峰面积值，将26个大黄样品的5个峰面积值作为变量，运用SPSS软件对其进行系统聚类分析，采用离差平方和法(Ward′s method)，利用欧氏距离(Euclidean distance)作为样品的测度，26个样品基本可分为两大类，样品1～15聚为第一类，均为栽培品；样品16～26聚为另一类，均为野生品。聚类分析结果见图2。
       2.11  掌叶大黄中蒽醌类成分与海拔高度间的关系掌叶大黄中蒽醌类成分的含量随海拔高度的变化较为明显，海拔较高的掌叶大黄其蒽醌类成分含量相对较高。运用SPSS软件对大黄中5个蒽醌类成分（芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚）峰面积和海拔高度进行相关分析，结果见表2。从表中可以看出，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量及其总量与海拔高度间均为极显著正相关，进一步说明了蒽醌类成分的含量随海拔高度的增加而显著增加。表2  掌叶大黄蒽醌类化学成分与海拔高度间的相关系数（略）
       3  讨论
          
       对不同产地野生和栽培掌叶大黄中蒽醌类成分测定结果显示，栽培掌叶大黄中5种蒽醌类成分的总量为0%～0.65%，野生掌叶大黄中5种蒽醌类成分的总量为1.78%～3.87%，野生掌叶大黄中蒽醌类成分的含量普遍高于栽培品，聚类分析结果也将野生掌叶大黄和栽培掌叶大黄样品明显地划为两类，进一步说明了野生品和栽培品在蒽醌类成分含量上存在较大差异。
       
       药用植物有效成分多为植物的次生代谢物，其在植物体内的积累很大程度上受生长环境各因素的直接或间接影响［2］。因此，对于药用植物（不论野生品种还是栽培品种）而言，有效成分与生境之间的关联关系值得研究，这对于提高栽培品的质量具有重要实际意义。
       
       有研究表明，植物化学成分与海拔高度间显著相关［3］。至于其形成原因，认为与不同海拔高度的光照、温度和湿度等环境因素不尽相同有关。本实验结果也表明，海拔对蒽醌类成分含量的影响达到极显著水平，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的含量均随海拔升高而升高。
       【参考文献】
         　　［1］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］. 北京：化学工业出版社，2005：17.
       
       ［2］董娟娥，梁宗锁，尉 芹，等. 不同区域松蓝根、叶(板蓝根、大青叶)有效成分含量差异［J］. 应用生态学报，2006，17(9)：1613.
       
       ［3］刘 雷，吴 卫，郑有良，等. 峨眉山不同山峪和海拔高度鱼腥草居群挥发油成分的变化［J］.生态学报，2007，27(6)：2239.