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       【摘要】 
       目的观察参芪复方对GK大鼠大血管病变血管内皮细胞凋亡的影响。方法设GK组、模型组、阿托伐他汀组、参芪复方组及Wistar正常对照组，各组大鼠灌胃及喂饲相应药物或饲料35 d。原位末端标记Tunel法观察内皮细胞平均荧光强度，进行内皮细胞凋亡程度评价，免疫组组织化学染色（SP法）测定caspase-3阳性物质积分光密度情况。结果阿托伐他汀组、参芪复方组内皮细胞平均荧光强度、内皮细胞凋亡程度、caspase-3积分光密度均低于模型组（P＜0.05或P＜0.01），阿托伐他汀组、参芪复方组间比较无差异。结论抑制主动脉血管内皮细胞凋亡及caspase-3表达可能是参芪复方防治糖尿病大血管早期病变的机制之一。
       【关键词】  参芪复方； 糖尿病大血管病变； 内皮细胞凋亡； caspase-3
       2004年《中国糖尿病防治指南》明确提出：糖尿病大血管病变已经成为我国糖尿病发病率和致死率最高、危害最大的慢性并发症，并且指出糖尿病动脉内皮细胞功能障碍、动脉内皮损伤，继之对血管损伤的反应提早发生和加速动脉粥样硬化是增加冠心病事件及死亡的重要原因［1］。现在认为糖尿病大血管并发症的主要病理过程是动脉粥样硬化，糖尿病人群大血管病变的发生与非糖尿病人群比具有发病更早，范围更广、病情更重的特点［2］。参芪复方是谢春光教授根据中医理论，针对消渴病气阴两虚、燥热津伤、瘀血阻滞之基本病机，具有益气养阴活血功效的自拟方。该方主要由人参、黄芪、生地黄、天花粉、山茱萸、山药、丹参、制大黄等8味中药组成。既往研究发现本方有抗2型糖尿病早期动脉粥样硬化的作用［3］。本研究在既往研究的基础上观察参芪复方对GK大鼠大血管病变内皮细胞凋亡影响。
       1  材料与仪器
       1.1  动物5月龄SPF级自发性2型糖尿病 GK雄性大鼠85只和雄性Wistar大鼠20只［购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，质量合格证号：SCXK（沪）2007～0005］，按2～3只笼饲养于四川省医学科学院﹠四川省人民医院实验动物中心，独立通气笼具（IVC）系统内。
       1.2  药品与试剂参芪复方浸膏（1 g浸膏相当于原生药10 g，由四川省中医药研究院中医研究所药剂科生产，批号：080928），阿托伐他汀钙片（10 mg/片，北京嘉林药业股份有限公司产品，批号：080502），Nω-硝基-L-精氨酸甲酯（ L-NAME，sigma公司产品，批号：107K 1055），原位细胞凋亡检测（POD试剂盒，美国Roche生产，货号：11 684 817 910），浓缩型DAB试剂盒（中杉金桥产品，货号：ZLI-9031），半胱胺酸蛋白酶蛋白-3（Caspase-3，北京博奥森产品，批号：03-297 ）。
       1.3  仪器光学显微镜（Motic BA200双目生物显微镜，麦克奥迪实业集团中国有限公司产品）， 明视场显微镜（Bx-40型，日本Olympus公司产品），荧光活体微循环显微镜（Ax70型，日本Olympus公司产品），Mias-2000图象分析系统 (四川大学智胜软件股份有限公司)等。
       2  方法
       2.1  分组及造模85只GK大鼠适应性饲养1周后，随机血糖值11.1mmol·L-1以上者73只入选本实验，查随机排列表将其随机分为GK组18只、模型组（简写为model）19只、西药阿托伐他汀组（简写为atorvastatin）18只、中药参芪复方组（简写为SQCR）18只， Wistar大鼠20只中剔除血糖值在6.7 mmol·L-1者2只，其余18只作为正常Wistar对照组（简写为Wistar），共5组。模型、西药、中药组均给予一氧化氮合成酶(NOS)抑制剂-L-NAME 0.1 mg·ml-1·d-1，加入饮用水中进行造模，GK、模型、西药、中药组喂饲高脂饲料，高脂饲料配方为：普通饲料88.2%、精练猪油10%、胆固醇1.5 %、猪胆盐0.3%，由四川省中医药科学院实验动物中心制成块料，Wistar组喂饲普通饲料。
       2.2  给药方法造模同时开始给药，周期35 d。具体如下：①正常Wistar对照组：按5 ml·kg-1·d-1灌服生理盐水；②GK组：按5 ml·kg-1·d-1灌服生理盐水；③模型组：按5 ml·kg-1·d-1灌服生理盐水；④atorvastatin组：按1.6 mg·kg-1·d-1 (相当于成人剂量10倍，成人体质量按60kg计)体质量灌服阿托伐他汀钙悬液；⑤SQCR组：按1.44 g·kg-1·d-1 (相当于成人剂量的10倍，成人按60kg计)体重灌服中药混悬液。
       2.3  观察指标及检测方法动物给药35 d后处死，腹腔注射8%戊巴比妥钠麻醉动物，取主动脉，冰上除去主动脉周围组织和腔内血液，固定组织，备免疫组织化学染色及原位末端标记Tunel法检测。
       2.3.1  内皮细胞平均荧光强度检测采用原位末端标记Tunel法检测，大鼠处死后，用10％中性甲醛固定24 h，梯度乙醇脱水，透明浸蜡，石蜡包埋过夜，纵向切片等处理，而后参照Roche原位细胞凋亡检测POD试剂盒及浓缩型DAB试剂盒操作，激发光波长450～500 nm，检测波长515～565 nm，在荧光活体微循环显微镜系统下观察荧光染色结果，每个组织＞400×视野下随机选5个视野，平均荧光强度＝累积荧光强度/发光物体的表面积。
       2.3.2  内皮细胞凋亡程度评价操作方法同上，观察了荧光染色情况后，用DAB复染，封片，在明视场显微镜下观察，每个组织400倍镜下随机选取5个视野，对主动脉内膜凋亡情况进行评价。计数凋亡内皮细胞数目：数目在1个以下，记作“－”；病变数目在1～5个之间，记作“+”；病变数目在6～10个之间，记作“++”；病变数目在10个以上，记作“+++”。同一只动物不同视野的不同情况，按最严重的级别计。最后，对主动脉内皮细胞凋亡情况进行统计分析。
       2.3.3  Caspase-3表达采用免疫组组织化学染色（SP法）测定Caspase-3阳性物质情况。用 OLYMPUS BX50光学显微镜(日本 OLYMPUS公司）观察染色结果，参考文献［4］，胞浆棕染为阳性，每张切片随机选5个视野，输入 Mias-2000图像分析系统（四川大学智胜软件股份有限公 司），在 200倍镜下分别测量内皮细胞Caspase-3阳性物质积分光密度及平均光密度并计算其均值。
       2.4  统计方法计量资料以±s表示，多样本均数的两两比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，用SPSS13.0统计软件进行。等级资料的比较采用Ridit分析。P＜0.05为有统计学意义。
       3  结果
       3.1  一般状况造模前，各组动物状态好，反应灵敏，被毛光泽。与正常Wistar对照组相比，GK大鼠摄食量偏少，饮水量偏多，尿量多，体重偏轻。实验过程中model组大鼠死亡3只，西药组大鼠死亡1只，中药组大鼠死亡2只。Wistar组与GK组大鼠均无死亡情况。
       3.2  参芪复方对各组大鼠凋亡内皮细胞平均荧光强度的影响如表1所示。从表1可以看出，模型组主动脉内膜凋亡内皮细胞平均荧光强度显著高于正常Wistar对照组（P＜0.01）；GK组主动脉内膜凋亡内皮细胞平均荧光强度显著低于模型组（P＜0.05）；两治疗组主动脉内膜凋亡内皮细胞平均荧光强度均显著低于模型组，其中参芪复方治疗组P＜0.01，阿托伐他汀治疗组P＜0.05；两治疗组之间主动脉内膜凋亡内皮细胞平均荧光强度比较均无差异。表1  胸主动脉内膜凋亡内皮细胞平均荧光强度的影响（略）
       3.3  参芪复方对内皮细胞凋亡程度的影响如表2及图1所示所示，从表2及图1看出，GK组、模型组主动脉内膜内皮细胞凋亡程度均显著高于正常Wistar对照组（P＜0.01）。阿托法伐汀组主动脉内膜内皮细胞凋亡程度比GK组有显著降低（P＜0.05）。两治疗组主动脉内膜内皮细胞凋亡程度与模型组比较均显著降低（P＜0.01）。两治疗组之间比较无差异。表2  对胸主动脉内膜内皮细胞凋亡程度的影响（略）
       3.4  参芪复方对Caspase-3表达的影响如表3所示，从表3可以看出，GK组与模型组Caspase-3积分光密度值显著高于正常Wistar对照组（P＜0.05或P＜0.01）；GK组及两治疗组Caspase-3积分光密度值均显著低于模型组（P＜0.01）。两治疗组之间积分光密度值比较无差异。表3  主动脉Caspase-3表达水平比较（略）
       4  讨论
          
       GK大鼠是国际上公认的自发性T2DM模型，较符合T2DM的病理生理特点。本实验灌胃给予GK大鼠NOS抑制剂加饲高脂饮食，成功复制出了DM早期大血管病变的动物模型。
         
       血管内皮由血管内皮细胞呈单层纵向排列衬于血管内壁，对血管起保护作用。糖尿病患者中，内皮功能异常是导致动脉粥样硬化的机制之一。细胞凋亡 (apoptosis) 是普遍存在于人体组织细胞内的细胞死亡的形式之一。研究表明，在炎症、高糖等多种因素刺激下，血管内皮可出现凋亡［5］。内皮细胞凋亡异常可能导致内皮功能异常，从而导致一系列病变的发生发展。凋亡在高血糖引起的损伤模型中尤为重要，在血管内皮组织损伤中也占有很大比重［6，7］。Caspase-3，亦称CPP32，在细胞凋亡发生过程中有重要作用。Caspase-3的活化是途经的关键环节。活化的Caspase-3可致蛋白酶级联切割放大，最终使细胞发生凋亡。检测 Caspase-3可较其它方法更能检测凋亡的早期事件［8］ 。
       
       近十年来的大量有关他汀防治冠心病的临床试验都一致证明，在预防动脉粥样硬化发生、发展方面，他汀是目前最有效的药物，有明确的保护血管内皮作用，且不影响血糖，不仅能减缓AS斑块的形成，减少斑块大小，还能稳定斑块，从而阻止AS斑块的进一步发展［9］，因此本研究选择他汀类药物作为阳性对照药物。
       
       本研究证实 ，参芪复方可显著减少模型组大鼠主动脉caspase-3的表达，减少凋亡内皮细胞平均荧光强度以及减低内皮细胞凋亡程度，且与西药治疗组比较没有差异。因此，抗凋亡作用可能成为参芪复方防治糖尿病大血管早期病变的机制之一。
       【参考文献】
         　　［1］卫生部疾病控制司，中华医学会糖尿病学分会.《中国糖尿病防治指南》试行本节选［S］. 中国慢性病预防与控制，2004，12（6）：283.
       
       ［2］王 姮，杨永年. 糖尿病现代治疗学［M］.北京科学出版社，2006：345.
       
       ［3］张红敏，陈世伟 ，谢春光 ，等.参芪复方抗自发性糖尿病GK大鼠早期动脉粥样硬化的作用机制 ［J］.中国中药杂志2006，31 (15)： 1272.
       
       ［4］李 辉，朱天明，张卫华，等. 参芪复方对GK大鼠胰岛β细胞凋亡及Caspase-3表达的影响［J］. 浙江中医杂志，2007，42（9）：536.
       
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       ［6］Ceriello A, Quagliaro L, D Amico M.Acute hyperglycemia induces nitrotyrosine formation and apoptosis in perfused heart from rat［J］. Diabetes，2002，51：1076.
       
       ［7］Zou MH, Shi C, Cohen RA. High glucose via peroxynitrite causes tyrosine nitration and inactivation of prostacyclin synthase that is associated with thromboxane/prostaglandin H(2) receptor-mediated apoptosis and adhesion molecule expression in cultured human aortic endothelial cells［J］. Diabetes，2002，51: 198.
       
       ［8］彭黎明，江 虹.细胞凋亡检测方法的研究进展［J］．中华病理学杂志，2001，20 (2)：13.
       
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