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       【摘要】 
       目的研究萃取柴胡皂苷a（SSa）的同时，萃取柴胡皂苷d(SSd)的工艺。方法以乙醇-水为共溶剂，利用SC-CO2萃取柴胡皂苷，利用高效液相色谱分析浸膏中皂苷的含量。结果该方法在萃取SSa的同时萃取出SSd，从而有效避免了SSd的热解。结论以乙醇-水溶液做共溶剂，利用超CO2（SC-CO2）萃取SSa和SSd的优化工艺条件为乙醇浓度为95%、用量为12ml/g萃余物，萃取温度为60℃，萃取压力为30MPa。萃取所得浸膏收率和浸膏中SSa的含量分别是水提醇沉法提取所得浸膏收率和浸膏中SSa含量的6倍和2倍。
       【关键词】  柴胡皂苷a； 柴胡皂苷d； 乙醇-水溶液
       柴胡是我国的传统中药和常用中药，具有疏散退热、疏肝解郁、升阳举气之功效，用于治疗寒热往来、胸满胁痛、口苦耳聋、头痛目眩等。柴胡皂苷(saikosaponins，SS)是柴胡的主要活性成分之一，具有解热、镇痛、镇静、消炎、抗病毒、免疫调节、保肝、护肾、促皮质酮激素等药理作用［1～4］。根据其化学结构不同柴胡皂苷可分为柴胡皂苷a、b、c和d等，一般认为柴胡皂苷a（SSa）和d(SSd)为其有效的活性成分，其中以SSd的药理活性最强［5，6］ 。柴胡皂苷传统的提取方法多采用水煎煮法或水提醇沉法，提取过程中柴胡皂苷a和d受热容易导致水解变性［7，8］。近年来，超临界CO2萃取技术作为一种新兴的萃取技术具有选择性好、萃取效率高、萃取温度接近室温等优点，特别适合对热不稳定的中药成分的提取。共溶剂（co-sovlent，又称夹带剂或改性剂）的加入极大地拓宽了SC-CO2萃取的应用范围，使得SC-CO2不仅用于挥发油等脂溶性成分的萃取，还用于皂苷类、醌类等极性成分的萃取［9，10］。已有的实验研究结果表明，利用乙醇-水溶液作共溶剂，可以在萃取皂苷a的同时萃取柴胡皂苷d［11］，但没有对萃取物中皂苷a、c和d的含量进行定量的测定。本文旨在以SSa和SSd为指标，以乙醇-水作共溶剂研究利用SC-CO2萃取柴胡皂苷，并将SC-CO2＋乙醇-水萃取工艺与传统的水提醇沉工艺进行比较。
       1  器材
       1.1  材料与试剂实验用原料为SC-CO2萃取柴胡挥发油的萃余物，简称萃余物。SSa和SSd标准品购自中国药品生物制品检定所，SSa标准品批号110777-200405，SSd标准品批号110778-200404。CO2纯度为99.9％，购自天津安兴气体有限公司。乙醇（分析纯）、甲醇（色谱纯）购自天津大学科威公司。
       
       1.2  仪器实验用超临界萃取设备为Spe-ed SFE型超临界萃取仪，购自美国Applied separations公司（Allenton， PA，USA）。实验设备如图1所示，主要包括升压系统、冷却系统、萃取系统和接收系统，设备详细的操作过程见文献［12］。
       2  方法
       　   
       实验前首先向萃取柱装入5 g萃余物。CO2经冷却槽冷却后经高压泵加压至所需压力，进入萃取柱，与预先装填好的萃余物混合。当萃取柱温度和压力升至设定的萃取温度和压力后打开出口阀，然后打开共溶剂泵将储罐的共溶剂加入萃取柱。溶解了柴胡皂苷提取物的共溶剂与SC-CO2混合物经过加压阀和微调阀进入接收瓶，CO2气体经湿式流量计计量后放空。萃取液旋转蒸发至近干，真空干燥箱干燥后称量浸膏量，计算浸膏萃取率，并利用高效液相色谱法分析浸膏中SSa和SSd的含量。其中浸膏萃取率（％）和浸膏中SSa和SSd的含量的计算公式为：
       
       浸膏萃取率（％）＝萃取所得浸膏质量（g）/萃取用萃余物质量（g）×100%①
       
       SSa/SSd含量（mg/g浸膏）＝浸膏中SSa/SSd的量（mg）/浸膏的质量（g）②
       2.1  水提醇沉法称取萃余物30 g，加入8倍量的蒸馏水，煎煮3 h，煎煮过程中补充4倍量蒸馏水，过滤，合并滤液，旋转蒸发浓缩至约1g/ml。将浓缩液均分4份，加入18倍原料量95%的乙醇，静置过夜后过滤，滤液在水浴温度50℃下旋转蒸发至近干，真空干燥后称量浸膏量，计算浸膏萃取率，并利用高效液相色谱法分析浸膏中SSa和SSd的含量。
       2.2  浸膏中SSa和SSd含量的测定利用高效液相色谱（HPLC）测定浸膏中SSa和SSd的含量。进行HPLC分析前首先利用大孔树脂对提取所得浸膏进行预处理： 取提取所得浸膏约0.1 g，加2%氢氧化钠溶液20 ml，超声加速溶解，分次加于AB-8大孔吸附树脂柱(60～100目，内径0.7 cm，长5 cm)上，用水约20 ml洗脱至无色，水液弃去，再用无水乙醇20 ml洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩至近干，用甲醇溶解并转移至5 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 μm微滤头过滤，即可作为样品液使用。
       HPLC分析用色谱柱为Turner C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)柱；流动相为乙腈-水(40∶60，V/V)，流速1 ml/min；柱温为室温；检测器为LabAlliance Model 500紫外检测器，检测波长210 nm；进样量20μl。
         
       精密称取SSa标准品和SSd标准品各2.5 mg，置5 ml容量瓶中，甲醇定容，依次吸取标准溶液0.2，0.4，0.6，0.8 ，1ml，甲醇稀释至5 ml。在HPLC分析条件下进样，以皂苷标准溶液进样液浓度为X轴，皂苷峰面积值为Y轴作图，在范围内得到两条直线，其回归方程为：
       
       SSa：Y=4E+06X+19 280      (r=0.998 3)③
       
       SSd：Y=4E+06X+5 640.5      (r=0.999 8)④
       3  结果
       3.1  超临界CO2＋乙醇-水溶液萃取工艺通过实验考察了乙醇浓度、共溶剂用量、萃取温度、萃取压力以及不同共溶剂加入方式对浸膏萃取率以及浸膏中SSa和SSd含量的影响。
       3.1.1  乙醇浓度的影响以不同浓度的乙醇-水溶液作共溶剂，考察乙醇浓度对浸膏萃取率以及浸膏中SSa和SSd含量的影响。萃取温度60℃、压力30 MPa，共溶剂流速1 min/L，用量为12 ml/g萃余物。结果见图2。
       
       从图2可以看出当乙醇浓度为70％时浸膏收率最大，这是因为水的溶胀作用使得更多的可溶性成分从萃余物基体上溶解下来，使得浸膏收率增大；当乙醇浓度从70％增大到95％时，浸膏收率降低，浸膏中SSa和SSd的含量增大，当乙醇浓度为95％时浸膏中SSa和SSd的含量最大，分别为15.44 mg/g浸膏和14.68 mg/g浸膏，说明乙醇浓度为95％时的萃取选择性最好。因此后续实验选择乙醇浓度为95％的乙醇-水溶液作共溶剂。
       3.1.2  共溶剂用量的影响萃取温度为60℃、压力为30MPa，以95％乙醇-水溶液作共溶剂，流速1 ml/min，用量为1.2 ml/g萃余物～18 ml/g萃余物，考察共溶剂用量对浸膏萃取率，以及浸膏中SSa和SSd含量的影响。实验结果见图3。
       
       从图3可以看出，当共溶剂用量从1.2 ml/g萃余物增加到12 ml/g萃余物时，浸膏收率和浸膏中SSa和SSd的含量增大，原因是随着共溶剂用量的增多，不断有新鲜溶液与萃余物接触，有利于增大溶质的溶解度，从而使得浸膏收率以及浸膏中SSa和SSd的含量增多。随着用量的继续增大，浸膏收率以及浸膏中SSa和SSd的含量基本保持不变，当共溶剂用量为12 ml/g萃余物时，SSa和SSd含量分别为15.44 mg/g浸膏和14.68 mg/g浸膏，共溶剂用量增大到18 mg/g浸膏时SSd的含量仅增加了17％，收率增加了21.10％，而共溶剂用量增加了50％，远远大于SSd收率和含量的增加，因此后续实验选择共溶剂用量为12 ml/g。
       3.1.3  萃取温度的影响萃取压力为30 MPa，共溶剂流速为1.0 ml/min，用量为12 ml/g萃余物，萃取温度分别为40，50，60℃和70   ℃，考察萃取温度对浸膏萃取率，以及浸膏中SSa和SSd含量的影响。实验结果见图4。当萃取温度从40℃升高到60℃时，浸膏收率以及浸膏中SSa和SSd的含量都增大，萃取温度升高，一方面增大溶质的饱和蒸气压，导致SSa和SSd溶解度增大；另一方面，升高温度有利于降低溶剂的黏度和表面张力，有利于溶质的脱附和扩散，从而导致浸膏收率和浸膏中SSa和SSd的含量增大。当温度升高到70℃时，收率有所下降，主要原因可能是温度升高导致CO2密度减小，从而导致溶质溶解度降低，浸膏收率以及浸膏中SSd的含量下降。
       3.1.4  萃取压力的影响萃取温度为60℃，共溶剂流速为1.0 ml/min，用量为12 mlg萃余物，萃取压力分别为10 MPa、20 MPa和30 MPa，考察萃取压力对浸膏萃取率，以及浸膏中SSa和SSd含量的影响。实验结果见图5。
       
       萃取压力从10 MPa升高到30 MPa，浸膏收率从10.94％增大到11.87％，仅增大8.50％；浸膏中SSa和SSd的含量分别增大5.97％和30.37％。原因是压力升高，SC-CO2密度增大，溶质溶解度增大，提取所得浸膏收率以及浸膏中SSa和SSd的含量增大；从另一方面考虑，随着萃取压力的升高，萃取所得浸膏收率和浸膏中SSa的含量变化不大，因此实际生产中可以根据实际情况选择萃取压力。
       3.2  SC-CO2与水提醇沉法的比较将SC-CO2萃取柴胡皂苷的实验结果与水提醇沉法提取柴胡皂苷的实验结果的比较见表1。表1  SC-CO2萃取法与水提醇沉法的比较（略）
       4  结论
          
       以乙醇-水溶液做共溶剂，利用SC-CO2萃取柴胡皂苷，可以在萃取SSa的同时萃取SSd，从而有效地避免传统水提醇沉法造成的SSd的热解。利用SC-CO2萃取所得浸膏收率约为水提醇沉提取所得浸膏的6倍，浸膏中SSa含量约是水提醇沉工艺提取所得浸膏中SSa含量的2倍。
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