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耳叶牛皮消颗粒对慢性萎缩性胃炎大鼠p53及PCNA蛋白表达的影响
作者:何行玲,彭传芬,黄祖明,郭莲军    
作者单位:湖北省宜昌市夷陵医院 443100;华中科技大学同济医学院,湖北 武汉 430030

《时珍国医国药》 2010年 第9期

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       【摘要】 
       目的观察耳叶牛皮消颗粒对实验性慢性萎缩性胃炎(CAG)大鼠p53基因及增生细胞核抗原(PCNA)表达的影响。方法采用热盐水灌胃方法制作CAG动物模型,以不同剂量的耳叶牛皮消颗粒进行治疗后,用免疫组化法检测大鼠胃黏膜p53及PCNA蛋白的表达。结果经过热盐水灌胃造模后,大鼠胃黏膜腺体萎缩。以耳叶牛皮消颗粒治疗后,大鼠胃黏膜腺体萎缩明显减轻,胃黏膜细胞p53阳性表达率和PCNA标记指数显著降低。结论耳叶牛皮消颗粒治疗CAG的机制可能是通过抑制突变型p53基因及PCNA蛋白的表达,从而恢复细胞增殖与凋亡的平衡来实现的。
       【关键词】  耳叶牛皮消颗粒; 慢性萎缩性胃炎; p53; PCNA
       慢性萎缩性胃炎(CAG)是消化系统疾病治疗中的难点之一,属于癌前病变,对人类健康威胁较大。耳叶牛皮消Cynanchum auriculatum Royle ex Wight为萝藦科鹅绒藤属植物,是广泛分布于四川、湖北等地的常用草药,具有养阴补虚、健脾消食之功效。笔者经研究发现,耳叶牛皮消能明显提高小鼠的小肠推进功能[1]。进一步以耳叶牛皮消、黄连、枳实、白术、三七等中药制成耳叶牛皮消颗粒,并观察了其对CAG大鼠胃黏膜p53及PCNA蛋白表达的影响。现报告如下。
       1  材料
       1.1   动物清洁级SD大鼠,体质量(200±20)g,♂,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供(动物生产许可证号:医动字第19-025号)。
       1.2   药物与试剂耳叶牛皮消颗粒由本院制剂室制备,批号:20070819,处方组成为耳叶牛皮消、黄连、枳实、党参、白术、茯苓、三七、白芍、法半夏、甘草、干姜,临用时用蒸馏水配制成合适浓度的混悬液。抗p53单克隆抗体(DO-1),由北京中山生物技术有限公司提供;PCNA单克隆抗体和LSAB试剂盒,由DAKO公司(日本)生产。
       2  方法
       2.1  模型制作及给药方法 
       取健康SD大鼠110只,随机分为5组,每组22只,即正常组、模型组和耳叶牛皮消高、中、低剂量组。除正常组外,其余各组均采用热盐水灌胃方法制作CAG动物模型[2]。即用55℃的15%氯化钠溶液灌胃,1次/d,每次2.5 ml,共12 周。实验开始,先处死5只正常组大鼠,并留取胃大体标本作为对照,以后各组每2周处死2只大鼠,取胃标本进行病理检查,以观察胃黏膜萎缩情况,判断造模是否成功。从第13周开始灌服药物治疗,至第24周末结束。其中耳叶牛皮消高、中、低剂量组分别予耳叶牛皮消颗粒相当于原生药5,2.5和1.25 g·kg-1·d-1灌胃,正常组和模型组予等量蒸馏水灌胃。
       2.2  检测指标及方法 
       各组实验结束将大鼠断头处死后剖腹取全胃,沿大弯剖开,生理盐水漂洗摊平作大体观察,沿胃小弯条状取材。胃黏膜标本经10%甲醛液固定,石蜡包埋切片。免疫组化采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶连接法(S-P),按试剂盒内说明书操作。阳性对照为已知阳性组织切片在同一条件下反应,阴性对照以正常兔血清代替第一抗体。结果判断标准参考文献[3]。p53结果按如下方法进行评分:①阳性着色程度:无着色为0,浅着色为1,深着色为2;②阳性着色范围:无着色为0,着色小于1/3为1,着色大于1/3为2,弥漫性着色为3。然后将以上两项评分相加,结果大于或等于三者为阳性病例。PCNA结果用PCNA标记指数(LI)表示:LI=PCNA阳性细胞数/计数细胞总数×100%。在高倍镜下选取5个有代表性的视野,每个视野记数100个细胞,计算PCNA阳性细胞表达率。
       2.3  数据处理 
       采用t检验和χ2检验,SAS统计软件计算机处理。
       3  结果
       p53阳性着色位于细胞核,呈棕黄色颗粒状,各切片显色分布不均,以片状和局灶性为主,少数为弥漫性分布。见图1。PCNA阳性着色位于细胞核,呈棕黄色细颗粒状。见图2。CAG模型大鼠在给予耳叶牛皮消颗粒治疗后,p53阳性表达率和PCNA LI明显降低。其中耳叶牛皮消高、中剂量组p53阳性表达率明显低于模型组(P<0.05),耳叶牛皮消各剂量组PCNA LI显著低于模型组(P<0.01或P<0.05)。见表1。表1  各组大鼠胃黏膜p53及PCNA蛋白的表达比较(略)
       4  讨论
       
   
       正常胃黏膜细胞的增生与凋亡维持着细胞总数的平衡,这种平衡的失调在CAG到胃癌的发展过程中起重要作用。细胞凋亡受众多基因调控,其中p53基因是与人类肿瘤发生相关性最高的突变基因,位于17号染色体短臂上,对细胞的生长有重要的调节作用。野生型p53基因能阻止具有癌变倾向的突变细胞出现,但它很容易转变成突变型p53基因而丧失调节功能,导致细胞恶性增生[4]。野生型p53基因表达的蛋白半衰期甚短,一般检测方法难以检出,而当基因发生突变时,其表达的蛋白质构型发生改变,半衰期延长,因此免疫组化测得的p53蛋白为突变型蛋白。正常胃黏膜细胞中无突变型p53表达,但在慢性萎缩性胃炎向肠上皮化生过程中,及在异型增生阶段内其阳性表达率增至60%[5]。PCNA又称周期素,是真核细胞DNA合成所必需的一种核蛋白,其合成与表达反映了细胞的增殖状态。PCNA阳性细胞的多少与肿瘤发展、预后均有密切关系。在CAG的肠化和不典型增生阶段,随着细胞增生活跃程度的加重,其PCNA阳性表达率明显增高[6]。本实验对热盐水致CAG模型大鼠胃黏膜细胞p53及PCNA蛋白的表达进行了免疫组化测定,发现其p53和PCNA阳性表达率处于较高水平。说明CAG模型大鼠细胞增殖活性明显升高,易于向恶性转化。给予耳叶牛皮消颗粒治疗后,大鼠胃黏膜细胞p53阳性表达率和PCNA LI显著降低。提示耳叶牛皮消颗粒治疗CAG的分子生物学机制可能是通过抑制突变型p53基因及PCNA蛋白的表达,从而恢复细胞增殖与凋亡的平衡来实现的。
       【参考文献】
           [1]李文胜,彭定国,屈万红,等.耳叶牛皮消对胃肠运动的作用及其机制研究[J].中国药房,2007,18(33):2575.
       
       [2]张 沥. 热盐水致大鼠萎缩性胃炎动物模型建立[J]. 世界华人消化杂志,2002,20:581.
       
       [3]伍银桥,王孟薇,吴本俨,等.胃癌变前后凋亡相关蛋白和PCNA的表达[J].世界华人消化杂志,2004,12(4):770.
       
       [4]Kaelin WG. The emerging p53 gene family[J]. National Cancer Inst, 1999, 91:594.
       
       [5]Shiao YH, Rugge M, Correa p, et al. p53 alteration in gastric precancerous lesions[J]. Am J Pathol, 1994,144: 511.
       
       [6]王仰坤,纪小龙,马乃绪,等.萎缩性胃炎中P53和PCNA的表达[J].新消化病学杂志,1997,5(4):237.

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