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       【摘要】 
       目的探讨海木提取物对小鼠学习记忆功能的影响。方法运用避暗法、跳台法、Morris水迷宫法等方法检测海木枝叶不同萃取物对正常小鼠及盐酸氯丙嗪、亚硝酸钠、乙醇所致记忆障碍小鼠学习记忆能力的影响，并筛选出最高活性部位。结果①海木各提取部位均能延长小鼠避暗实验的潜伏期，减少错误次数，其中氯仿部位活性最高（P＜0.01）；②氯仿萃取物的中、大剂量组与对照组比较，能显著缩短正常小鼠定位航行实验中的逃避潜伏期，增加经过原平台的次数以及在原平台象限停留的时间（P＜0.05）；③氯仿萃取物对盐酸氯丙嗪、亚硝酸钠及乙醇所致记忆障碍小鼠均具有显著的改善作用（P＜0.05）。结论海木提取物具有增强正常小鼠学习记忆能力，改善学习记忆障碍小鼠学习记忆能力的作用，其中氯仿萃取物为最高活性部位，其作用呈现一定的量效关系。
       【关键词】  海木； 小鼠； 学习记忆
       海木Trichilia connaroides为楝科（Meliaceae）植物，别名老虎楝、鸡波、鹧鸪花，在我国主要分布于广西、云南、贵州［1］。民间用药中，海木的根常被作为治疗关节炎、咽喉炎、扁桃体炎和其他疾病的方药［2］，有清热解毒，祛风湿腰腿痛和心、胃气痛等功效［3］。有研究报道，海木氯仿提取物对通过化学处理、热处理和甲醛诱导处理的昆明小鼠和Wistar大鼠建立的炎症模型，表现出显著的依赖性止痛作用和抗炎活性［4］。关于海木影响学习记忆功能的研究，目前尚未有报道。本文以昆明小鼠为对象，探讨海木提取物对学习记忆功能的作用。
       1  材料与仪器
       　
       1.1  动物昆明小鼠300只，体质量为（25±5）g，雄性，清洁级，购于广西医科大学实验动物中心。许可证号：SCXK桂2003-000。
       1.2  药物和试剂
       海木枝叶于2009-03采于广西桂林市永福县寿城，经广西植物研究所刘演研究员鉴定为楝科植物海木（Trichilia connaroides）。采后粉碎，60度烘干备用；75%消毒酒精、乙醇（分析纯）、石油醚（分析纯）、氯仿（分析纯）均购于天津福晨化学试剂厂；正丁醇（分析纯），购于上海申博化工有限公司；0.9﹪氯化钠注射液（广西南宁百会药业集团有限公司，生产批号：0902003）；银杏叶片（12×24s，桂林益佰漓江制药有限公司，生产批号：090901）；盐酸氯丙嗪注射液（50 mg∕2 ml，上海禾丰制药有限公司，生产批号：080502）；亚硝酸钠（北京益利精细化学品有限公司，生产批号：991116）；无水乙醇（分析纯）（广东光华化学厂有限公司，生产批号：20090115）。
       
       1.3  仪器BA—200小鼠避暗仪，DT—200小鼠跳台测试箱，MT—200Morris水迷宫视频跟踪分析系统，均由成都泰盟科技有限公司提供，RE—200旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），SHZ—D（Ⅲ）循环水式真空泵（巩仪市予华仪器有限责任公司），电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）等。
       2  方法
       2.1  海木萃取物的制备
       称取海木干枝叶适量，加入适量的无水乙醇，加热回流2h，用四层纱布过滤，得到的上清液提取液，重复提取3次，合并提取液，减压回收溶剂，得膏状物，将此膏状物用乙醇∶水=1∶3的比例除去叶绿素，回收溶剂至干，即得粗提部分。将所得粗提物分成两份，一份备用，另一份依次用石油醚、氯仿、正丁醇、水进行固-液萃取，即得到石油醚部分、氯仿部分、正丁醇部分、水提部分。将各部分分别减压回收溶剂至干，最后得到的膏状物即是石油醚萃取物、氯仿萃取物、正丁醇萃取物和水提物。
       2.2  动物分组在各项实验分组之前均用相应的仪器对小鼠进行神经行为学测试和筛选，剔除与其他小鼠具有较大差异的，再将其余的小鼠随机分组，每组10只。
       2.3  海木对正常小鼠学习记忆功能作用的活性部位筛选（避暗法）将小鼠分为正常组、粗提物组、石油醚组、氯仿组、正丁醇组、水提物组和阳性对照组共7组。各给药组按100 mg/kg剂量灌胃1 ml，正常对照组灌胃等容量的生理盐水，阳性对照组按16 mg/kg剂量灌胃等容量银杏叶片溶液，1次/d，连续给药10 d，于给药第9天进行避暗训练，第10天给药后30 min按文献［5］方法测定小鼠在避暗仪中30 min内的错误次数（进入暗室受到电击的次数）和潜伏期（每只小鼠放入明室从开始测试到第一次进入暗室的时间）。
       2.4  海木氯仿萃取物对正常小鼠空间记忆功能的影响（Morris水迷宫法）将小鼠分为正常组、氯仿萃取物小、中、大剂量组和阳性对照组共5组。给药组分别按50，100，150 mg/kg剂量灌胃海木氯仿萃取物1 ml，正常对照组灌胃等量生理盐水，阳性对照组按16 mg/kg剂量灌胃等量银杏叶片溶液，1次/d，连续给药10 d。于给药第5天进行1次定位航行训练，于末次给药后30 min按文献［6］方法测定小鼠寻找平台潜伏期及撤除平台后经过原平台的次数及在原平台象限停留的时间。
       2.5  海木氯仿萃取物对盐酸氯丙嗪所致记忆获得障碍小鼠的影响（避暗法）动物分组和给药与“2.4”同，除正常对照组外，实验小鼠于给药第9天皮下注射盐酸氯丙嗪注射液（4 mg/kg），30 min后进行避暗训练，第10天末次给药30 min后测定小鼠在避暗箱中30 min内的错误次数和潜伏期。
       2.6  海木氯仿萃取物对亚硝酸钠所致记忆巩固障碍小鼠的影响（跳台法）动物分组和给药与“2.4”同，除正常对照组外，实验小鼠于给药第9天进行跳台训练后立即皮下注射亚硝酸钠水溶液（120 mg/kg），第10天末次给药30 min后按文献［5］方法测定小鼠在跳台测试箱中30 min内的错误次数及潜伏期。
       2.7  海木氯仿萃取物对乙醇所致记忆再现障碍小鼠的影响（跳台法）动物分组和给药与“2.4”同，实验小鼠于给药第9天进行跳台训练，第10天除正常对照组外，在末次给药后灌胃40%乙醇（0.1 ml/10 g），30 min后测定小鼠在跳台测试箱中30 min内的错误次数及潜伏期。
       2.8  数据处理所有数据以±s表示,数据统计分析采用SPSS13.for windows统计软件进行组间t检验和单因素方差分析比较组间差异，P＜0.05 为差异具有显著性，P＜0.01为具有非常显著性差异。
       3  结果
       3.1  海木对正常小鼠学习记忆功能作用的活性部位筛选由表1可见，与正常对照组比较，海木枝叶5种不同萃取物都能不同程度延长潜伏期，减少错误次数。其中氯仿萃取物的作用最为显著，潜伏期最长，错误次数最少（P＜0.01），其次是正丁醇萃取物，潜伏期较长，错误次数较少（P＜0.05）。其余3种萃取物与对照组相比，也能延长潜伏期，减少错误次数，但无统计学意义。表1  海木不同萃取物对小鼠学习记忆的影响（略）
       3.2  海木氯仿萃取物对正常小鼠学习记忆功能的影响结果见表2。灌胃海木枝叶氯仿萃取物的大、中、小3个剂量组，在定位航行实验和空间搜索实验中均表现出增强空间学习记忆的能力。与正常对照组比较，大、中、小3个剂量组的逃避潜伏期均减少，经过原平台次数及在原平台象限停留的时间均有增加。其中大剂量组的逃避潜伏期最短，有非常显著性差异（P＜0.01），经过原平台的次数最多，有显著性差异（P＜0.05），在原平台象限停留的时间最长，有非常显著性差异（P＜0.01）；其次是中剂量组，逃避潜伏期与在原平台象限停留的时间，与正常对照组比较，有显著性差异（P＜0.05）。表2  海木氯仿萃取物对正常小鼠学习记忆功能的影响（Morris水迷宫法）（略）
       3.3  海木对盐酸氯丙嗪所致记忆获得障碍小鼠的影响结果见表3。与模型组比较，大、中、小3个剂量组在30 min的潜伏期均有增大，其中大剂量组的潜伏期最长，有非常显著性差异（P＜0.01），其次是中剂量组的，有显著性差异（P＜0.05）；各剂量组错误次数均明显减少，差异非常显著（P＜0.01）。表3  海木氯仿萃取物对盐酸氯丙嗪所致记忆获得障碍小鼠的影响（略）
       3.4  海木氯仿萃取物对亚硝酸钠所致记忆巩固障碍小鼠的影响结果见表4。与模型组比较，大、中、小3个剂量组在30min的潜伏期均有增大，其中，大、中剂量组的潜伏期相对较长，有显著性差异P＜0.05）；各剂量组错误次数均明显减少，有非常显著性差异（P＜0.01）。表4  海木氯仿萃取物对亚硝酸钠所致记忆巩固障碍小鼠的影响（略）
       3.5  海木氯仿萃取物对乙醇所致记忆再现障碍小鼠的影响结果见表5。与模型组比较，大、中、小3个剂量组在30 min的潜伏期均有增大，其中大剂量组的潜伏期最长，有非常显著性差异（P＜0.01），其次是中剂量组，有显著性差异（P＜0.05）；各剂量组错误次数均有非常显著性差异（P＜0.01）。表5  海木氯仿萃取物对乙醇所致记忆再现障碍小鼠的影响（跳台法）（略）
       4  讨论
         
       学习记忆属于高级神经活动,其基本过程可以大致分为获得(acquisition)、巩固(consolidation)和再现(retrieval)3个阶段［7］。根据记忆过程的生理生化基础,在进行益智药物研究中,通常在训练前或训练后不同时间给予动物采用一些化学药物,造成各种记忆障碍模型。此种模型较正常动物更能正确反映药物的作用,从而可用于益智药物的筛选或初步分析其作用机理［8］。
       
       本研究观察了海木5种不同萃取物对正常小鼠学习记忆功能的影响，结果显示，氯仿萃取物活性最高，其对正常小鼠的学习和空间记忆能力均表现出显著的增强作用，与正常组比较差异非常明显(P<0.01)。并且海木氯仿萃取物各剂量组的测试成绩随剂量的增大而越好，呈现一定的量效关系，其中高、中剂量组的成绩明显好于正常组(P<0.01或P<0.05)，说明经过一段时间的给药，小鼠的学习记忆能力有一定的增强。
       
       盐酸氯丙嗪对多巴胺受体、5-羟色胺受体、α-肾上腺素受体、M-型乙酰胆碱受体具有阻断作用［9］，该药能特异性阻滞由第一级记忆向第二级记忆转移过程，采用训练前给药以破坏动物识记过程，造成记忆获得障碍。本实验用盐酸氯丙嗪造模后，模型组测试成绩明显差于正常组(P<0.01或P<0.05)，说明造模成功。而海木氯仿萃取物的中、大剂量组及阳性组的测试成绩显著好于模型组(P<0.01或P<0.05)，说明海木氯仿萃取物能显著对抗盐酸氯丙嗪造成的记忆获得障碍，这可能是通过拮抗盐酸氯丙嗪对多巴胺受体、5-羟色胺受体、α-肾上腺素受体、M-型乙酰胆碱受体的阻断作用，保持递质受体一定的浓度，从而提高神经递质的含量，对抗盐酸氯丙嗪的中枢抑制，促进记忆的改善。
       
       亚硝酸钠是致缺氧剂，大量进入机体后，可使正常的血红蛋白变为高铁血红蛋白，失去携带氧的功能，引起组织缺氧，造成记忆巩固障碍［10］。注射亚硝酸钠造模后，模型组成绩显著差于正常组(P<0.01或P<0.05)，说明造模成功。海木氯仿萃取物各组及阳性组成绩显著好于模型组(P<0.01或P<0.05)，且随剂量的增大效果越好。说明海木氯仿萃取物能显著对抗亚硝酸钠所造成的记忆巩固障碍，提示其可能具有促进脑代谢，对缺氧缺血等脑损伤有保护作用。
       
       乙醇也是中枢神经抑制剂，可抑制动物的条件反射过程，使脑内蛋白质和RNA合成受阻，胆碱能和多巴胺等系统发生改变，破坏学习记忆功能［11］。在测试前给药,可明显干扰记忆的再现，造成记忆再现障碍。灌胃乙醇造模后，模型组成绩显著差于正常组(P<0.01或P<0.05)，说明造模成功。海木氯仿萃取物中、大剂量组及阳性组显著好于模型组(P<0.01或P<0.05)。说明海木氯仿萃取物能显著对抗乙醇所造成的中枢神经抑制。20%～40﹪乙醇是致脑缺氧剂，海木氯仿萃取物对乙醇中枢抑制的记忆再现障碍的改善，可能与其改善脑血流量，促进脑内蛋白质和RNA合成等作用有关。
         
       综上所述，海木氯仿萃取物能显著增强正常小鼠的学习记忆能力，对抗不同化学试剂所造成的记忆障碍，并且结果比较一致：海木氯仿萃取物各组的测试成绩随剂量的增大而越好，呈现一定的量效关系。至于海木氯仿萃取物增强小鼠学习记忆功能的有效成分是什么化合物，其作用机制如何，有待进一步深入研究。关于其活性成分的跟踪分离工作我们正在进行中。
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