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       【摘要】 
       目的确定适合何首乌RAPD-PCR的基因组DNA提取方法及最适宜反应体系。方法通过改良的CTAB法提取何首乌基因组DNA，研究其用于RAPD-PCR的可行性。利用正交设计方法L16 (45)，针对Tag酶，引物，dNTP，镁离子，模板设计了5因素4水平的正交实验，优化RAPD-PCR反应体系。结果正交设计结果表明，可以得到几种不同的有效扩增反应体系组合。根据实际需求，最适宜的RAPD-PCR反应体系为20 μl，其中1×PCR buffer, Tag酶 1U，引物 1 μmol/L，镁离子 2 mmol/L，dNTP 300 μmol/L，模板 40 ng。结论改良的CTAB法和正交优化得到的反应体系适合用于何首乌RAPD遗传多样性分析。
       【关键词】  何首乌； DNA提取； RAPD； 正交设计
       何首乌是我国传统医药中的名贵药材，何首乌块根及茎叶均可入药。何首乌具有补肝肾、益精血、乌须黑发、养心安神等功效，主治血虚身痛、心烦失眠、劳伤多汗等症。同时可用于保健和食品等多方面，何首乌块根富含淀粉，含量高达45.2%，药食两用。
       
       RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)技术是由美国学者Williams［1］和Welsh［2］两个研究团队在1990年几乎同时发展起来的。Williams等在发现RAPD多态性的同时还证明了RAPD标记的分离情况符合孟德尔遗传规律，因而明确了RAPD作为分子标记用于研究生物遗传变异的理论基础。RAPD分子标记建立在PCR基础之上。通过使用一系列具有10个碱基的单链随机引物，对基因组的全部DNA进行PCR扩增以检测多态性。RAPD技术因其操作简便、反应迅速、成本低和DNA用量少等优点而被广泛应用于药用植物种内或种间亲缘关系和遗传多样性方面的研究。然而，RAPD反应这项技术还不是很稳定，重复性差，不过这个可以通过优化反应体系和条件加以改进。因此，在利用RAPD标记进行分析时需要建立一套稳定的反应体系和扩增程序，从而获得相对稳定且重复性好的RAPD分析结果。
       
       本文通过改良后的CTAB法提取何首乌基因组DNA［3, 4］ ，分析了该方法提取的DNA用于RAPD分析的可行性。然后，采用正交设计法来安排RAPD试验，由于其所安排的试验具有整齐可比和均衡分散的特点，可以全面了解试验的情况和各因子之间相互影响的规律。所以正交设计实验从多因素试验结果中得出适合何首乌RAPD分析的优良反应体系，同时又避免了单因素设计方法的繁琐且没有统计学意义的优化过程。
       1  材料与仪器
       1.1  材料广东高州，广西靖西，广东东莞，广东湛江，广东深圳，广东德庆，广西德保等7个产地的何首乌，经华南植物园邢福武教授鉴定，将何首乌块根置于-20℃冰箱中保存备用。
       1.2  仪器与试剂博日TC-24/H(b)型基因扩增仪（杭州博日科技有限公司），BECKMAN DU 530型分光光度计（BECKMAN公司），BIO-RAD凝胶成像系统（BIO-RAD公司），BECKMAN Microfuge  22R冷冻离心机（BECKMAN公司），稳压稳流电泳仪（BIO-RAD公司）
       
       Tag酶，dNTP,Mg2+,10×PCR buffer，λ-EcoT14Ⅰdigest，DL2000均购自TaKaRa公司，随机引物(invitrogen)，DNA Marker Ⅲ(天根公司)，CTAB(Amresco)，PVP(Sigma)，β-巯基乙醇(Sigma)，RNase A(Sigma)，琼脂糖(Biowest)，其余的化学试剂均为国产分析纯。
       2  方法
       2.1  DNA提取及质量检测称取0. 2 g硅胶干燥何首乌块根，置于液氮中速冻30 s，再迅速研磨使呈糊状或粉状，将糊状或粉状物转入2.0 ml eppendorf管中；加入700 μl CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）抽提缓冲液65℃保温45～60 min，期间轻缓颠倒摇动数次，取出eppendorf管，使之恢复室温；加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1)抽提，轻缓颠倒混匀，室温下8 000 r/min离心20 min； 吸取上清液,加入100 μl体积的10% CTAB溶液(10%CTAB, 0.7 mol/L NaCl)，再加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1)，重复抽提1次，轻缓颠倒混匀,室温下8 000 r/min离心20 min；吸取上清,加入200 μl体积的NaAc和等体积预冷异丙醇，混匀，-20℃下放置30 min以上, 8 000 r/min离心20 min，去上清后分别用70%乙醇和90%乙醇各洗涤1次, 室温吹干后溶于50 μl，无菌双蒸水中,用RNase A于37℃处理1 h去除RNA，分装后放入- 20℃储存或放入4℃待用。
       
       DNA样品用无菌双蒸水溶解并稀释后,于260，280 nm 处用分光光度计进行浓度测定。通过260 nm处的吸光值A260计算浓度，浓度(ng/μl)=50 ng/μl×A260×稀释倍数。并用0.6%琼脂糖凝胶，电压95 V，在1×TAE电泳缓冲液中电泳30 min检测DNA模板质量，最后对所提的DNA做一个RAPD预扩增，采用的反应体系和扩增程序参照高永利等［5］的方法。
       2.2  RAPD- PCR反应体系的正交设计方案选择Tag DNA聚合酶，引物，Mg2+，dNTP，模板5个主要影响影响RAPD-PCR反应的因素进行正交实验设计，每个因素选择4个浓度水平，设计因素水平表。见表1。由于RAPD-PCR反应体系较复杂，RAPD-PCR电泳图谱主要以直观判别，故不考虑各因素之间的交互作用。根据正交设计实验表L16(45)安排实验方案。见表2。表1  正交实验设计因素水平表，表2  L16(45)正交实验计划表（略）
       
       2.3  RAPD- PCR实验正交优化根据表2的方案，每个实验都采用的是20 μl反应体系，依据正交计划表次加入各反应成分，用灭菌双蒸水补充总体积至20 μl。在PCR仪上扩增，热循环参数为94℃预变性5 min，94℃变性1 min，37℃退火1 min，72℃延伸2 min，如此进行40个循环，最后72℃延伸7 min［6］ 。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳检测，电压为90 V，1×TAE电泳缓冲液中电泳25min，电泳结束后置于凝胶成像系统中观察并拍照。
       3  结果
       3.1  基因组DNA浓度及质量检测改良后的CTAB法提取的DNA呈白色半透明状，溶于水。用灭菌双蒸水稀释100倍后测定A260和A280处的吸光值，计算后得到的结果见表3。表3  基因组DNA浓度及纯度（略）
        表3数据显示，改良后的CTAB法提取到的DNA浓度较高，纯度也在正常的范围之内。此外，还通过对所提取基因组DNA进行电泳检测，进一步的测定其质量，如图1。
       根据电泳图显示可知，基因组DNA整体质量很均一，分子量大概都在20 kb左右，无其他的条带出现。泳道有一点弥散，说明DNA有稍微的降解，3号孔亮度最大，且点样孔有一点亮，说明其浓度是最高的，并有一点蛋白污染，这点也直接的证实了表3中的数值是可信的。
       
       通过上面的外部观测，紫外检测和电泳检测，基本上可以确定基因组DNA的提取是可取的，为了证实这些模板DNA可以用于RAPD-PCR，对其进行了RAPD预扩增，得到图2。
         
       图2所示，通过对模板DNA进行RAPD预扩增可知，用改良后的CTAB法提取得到的DNA，在浓度，质量和适合RAPD扩增方面都是可行的。
       3.2  何首乌RAPD-PCR反应体系的正交优化
       如图3，按照表2依次加入反应体系后，使用引物OPZ-18，模板为广西靖西何首乌基因组DNA。参照谢运海等［7］ 的方法，根据谱带强弱和条数，对RAPD-PCR扩增结果进行直观分析。在图3中可以直观的看出，16个不同组合中扩增存在着明显的差异，有些组合甚至没有条带出现，12，15条带虽然亮度较强，且多态性好，但是有明显的弥散现象，应该是Tag酶过多的原因。10，13，14，16号孔均条带较暗且多态性不好，1，2，3，7条带虽然较亮，但是多态性不好。5，12号孔扩增效果较好，谱带清晰，多态性好，然而背景有一些弥散。 4号孔扩增效果最好，条带清晰，多态性好。
       4  讨论
          
       对于植物新鲜组织DNA的提取，已有比较成熟和可行的方法［8, 9］ 。然而，对于中药材，其药用部位大都是老组织或是已经没有生命力的组织，其中沉积的次生代谢物很多，例如多糖，酚类等物质，这些都影响到基因组DNA的提取和质量。由于使用的是何首乌块根，里面的各种次生代谢物很多，主要是一些多糖难以去除，且容易与DNA形成复合物。不仅影响基因组DNA的质量，而且其是否会对RAPD扩增产生影响也是亟待解决的。研究后发现，通过改良后的CTAB法提取何首乌基因组，其浓度和质量已经符合实验的要求。在对其进行RAPD预扩增时也证明了该方法提取的基因组DNA用于RAPD分析的可行性。
       
       RAPD反应体系的优劣主要通过谱带的强弱和条数来确定的。本实验采用正交设计方法，实验结果也是通过直接观察判别，而不用进行定量分析。传统优化实验中镁离子、dNTP、引物都有一个有效扩增浓度范围，低于或高于此浓度则不能进行有效扩增。然而正交实验设计后，Tag酶，引物，镁离子，dNTP，模板5个因素各个水平在不同有效扩增中均有出现，也说明了RAPD-PCR能否有效扩增的各组分浓度其实也是一个相对的动态过程。
       
       Tag酶浓度也不宜过高，否则容易引起非特异性扩增和加深背景。引物也是如此，过高的引物浓度易引起错误引导，并使背景加深，降低遗传多样性分析统计的可靠性。图3中，8，11，13号孔均没有条带出现，说明没有有效扩增，主要是因为dNTP浓度过高，达到500 μmol/L，而镁离子的浓度却没有增加到一定的浓度，使体系中游离的镁离子浓度降低，降低酶的活性。2号孔条带较清晰，dNTP浓度同样是500 μmol/L，但是镁离子浓度也同样达到了4 mmol/L，所以可以有效扩增。然而，体系中，各组分的浓度也不能过高，2，5，12，15号孔背景有一点弥散，主要是由于镁离子浓度过高引起。当然，镁离子浓度也不能过低，3，6，9，14号孔镁离子浓度为1 mmol/L，虽然有些可以有效扩增，但是由于Tag酶活性得不到很好的激活，产物产量低，条带暗淡。RAPD对于模板的要求并不是特别高，反应中DNA模板适应的浓度较大，高浓度的模板对RAPD扩增影响不大，这个与传统的优化方法一致。总之，通过改良的CTAB法提取何首乌基因组DNA，得到了适合RAPD分析的基因组DNA提取方法，并通过正交实验得到多个有效的扩增组合，避免了传统优化方法经常出现的繁琐和不稳定的现象，并且体现了各个影响因素的动态交互作用，可以根据成本和实际的需求选择一个最佳的组合。
       【参考文献】
         　　［1］Williams J G, Kubelik A R, Livak K J, et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers.［J］. Nucleic Acids Res, 1990, 18(22): 6531.
       
       ［2］Welsh J, Mcclelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers.［J］. Nucleic Acids Res, 1990, 18(24): 7213.
       
       ［3］赵 翾， 赵树进. 白木香基因组DNA提取方法研究［J］. 河南工业大学学报(自然科学版), 2006, 27(3): 13.
       
       ［4］严 萍，赵树进. 中药何首乌总基因组DNA的提取［J］. 时珍国医国药，2007，18(3): 607.
       
       ［5］高永利，李景富，王傲雪，等. 番茄RAPD反应体系的优化［J］. 东北农业大学学报，2007，38(2): 175.
       
       ［6］赵喜华，张乐华，王曼莹. 杜鹃属基因组DNA提取及RAPD的检定［J］. 生物技术，2005，15(5): 43.
       
       ［7］谢运海，夏德安，姜 静，等. 利用正交设计优化水曲柳ISSR-PCR反应体系［J］. 分子植物育种，2005，3(3): 445.
       
       ［8］胡雅琴，肖娅萍，王孝安，等. 几种松科植物基因组总DNA的提取［J］. 西北植物学报，2004，24(3): 523.
       
       ［9］文晓鹏，邓秀新. 五种蔷薇属植物基因组DNA的提取及鉴定［J］. 种子，2002，126(6): 18.