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       【摘要】 
       目的比较黄连复合生物碱与单一生物碱的降糖作用。方法检测黄连复合生物碱及单一生物碱（小檗碱、药根碱、巴马汀碱、黄连碱）对人肝癌细胞HepG2的葡萄糖消耗量及对细胞存活率的影响；以四氧嘧啶获得高血糖小鼠模型，然后检测黄连生物碱对小鼠血糖值的影响。结果0.2～5 mg·L-1的生物碱即对细胞表现出降糖活性，小檗碱在5 mg·L-1时有显著细胞毒性。4种黄连生物碱单体中，小檗碱降糖活性较高，巴马汀降糖活性较差；复合生物碱具有比单一生物碱更好的降糖作用，且复合生物碱没有细胞毒性。结论黄连生物碱降糖活性存在协同作用，且安全性比单一生物碱更高。
       【关键词】  黄连生物碱； HepG2细胞； 降糖活性； 协同作用
       糖尿病防治是全球关注的重大健康问题，目前全球约有1.5亿患者［1］，预防和治疗糖尿病是一项非常迫切的任务。
       
       黄连味苦、性寒，入心、肝、胃、大肠经，可清热燥湿，泻火解毒，作为中医治疗“消渴”病的常用药物而一直被临床广泛使用。黄连的有效成分为黄连生物碱，主要代表为小檗碱（BBR），约占总生物碱的50%；此外，尚含有巴马丁、黄连碱、甲基黄连碱、药根碱、木兰碱等，而小檗碱、巴马丁、黄连碱、药根碱等4个生物碱之和占总生物碱的90%［2］。大量的研究结果表明，BBR能够激活细胞中AMPK的活力、增加细胞对葡萄糖的消耗［3，4］、降低胰岛素抵抗等作用，显示出良好的治疗2型糖尿病作用［5］。
       
       研究结果表明黄连总生物碱显示出比BBR更好的降糖活性：给小鼠灌喂BBR单体和含相同量BBR的黄连原粉后，发现黄连的降糖作用比BBR更强［6］。本研究利用HepG2细胞降糖实验方法和动物实验方法比较黄连总生物碱和小檗碱的降糖活性，为黄连活性成分类群的开发利用提供参考。
       1  仪器与试剂
       1.1  试验仪器Thermo 6500 二氧化碳培养箱，Eos Bravo W 全自动生化分析仪，金净 JJ-CJ-2F 洁净工作台，BioTek ELX800 酶标仪，ZEISS Axiovert 40 CFL倒置显微镜。
       1.2  材料与试剂人肝癌胚胎瘤细胞HepG2购自中国典型培养物保藏中心。特级胎牛血清，批号 16000-044、RPMI 1640培养基，批号 31800-22，Gibco公司。葡萄糖酶法测定试剂盒，批号 364500，购自南京建成生物工程研究所。四甲基偶氮唑盐（MTT），胰蛋白酶，购自Sigma公司。人注射用胰岛素，批号 0909214，购自万邦生化医药公司。小檗碱、药根碱、巴马汀碱和黄连碱对照品，购自成都曼斯特公司，纯度98%。实验用黄连生物碱是从黄连中分离纯化制备而得，纯度98％以上。盐酸二甲双胍，购自南京泽朗植提，纯度98%。清洁级昆明种小鼠，体质量18～22 g，合格证号No.0002400,第三军医大学动物室提供。
       2  方法
       2.1  细胞实验方法［7］
       2.1.1  药物制备MTT、生物碱与阳性对照药二甲双胍均用PBS缓冲液配制，过滤除菌。使用时与含10% FBS的培养基按1：9比例混溶，药物终浓度为0.2，1，5 mg·L-1；MTT浓度5 g·L-1。
        　
       复合生物碱的比例见表1。表1  黄连生物碱复合物的配比（略）
       2.1.2  HepG2细胞的培养在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中培养，CO2浓度5%并保持饱和湿度，对增殖状况良好的细胞用0.25%的胰酶消化并进行传代。
       2.1.3   降糖试验及MTT试验将消化并稀释好的HepG2细胞加入到96孔板中，待细胞铺满率达80%，换掉原培养基，用PBS缓冲液清洗1次，将96孔板随机分为16组，每组每孔加入250 μl含药或不含药的培养液。24 h后利用葡萄糖酶法测定试剂盒于全自动生化分析仪中利用终点法，在505 nm波长下检测培养液中葡萄糖剩余量（试剂盒购自南京建成生物工程研究所），并加MTT，4 h后于酶标仪中490 nm波长下检测吸光度值。
       2.1.4  药物对胰岛素处理后降糖活性试验将对数生长期细胞用胰酶消化并加入96孔板中，待细胞贴壁，移去培养液，加PBS清洗1次，换上含2.8×10-6 mol·L-1胰岛素及2% FBS的RPMI1640培养液，并设不含胰岛素的空白对照培养12 h。移去培养液，PBS清洗1次，换上含各种药物的无血清培养液。培养24 h后检测培养液中GLU消耗。
       2.2  降血糖动物实验［8］清洁级昆明种小鼠，体质量18～22 g，购自第三军医大学动物室（实验动物的合格证号为（No.0002400））。小鼠平衡饲养3 d后，饥饿12 h，然后尾部静脉注射四氧嘧啶（70 mg·kg-1）。3 d后，检测血糖。取血糖为10～25mmol/L的小鼠作为高血糖模型小鼠，按照血糖分为7组，每组10只。然后灌胃小檗碱（100 mg·kg-1）、黄连碱（100 mg·kg-1）、药根碱（100 mg·kg-1）、巴马汀（100 mg·kg-1）和黄连总生物碱（4号复合物，100 mg·kg-1），高糖对照组灌胃蒸馏水，阳性对照组灌胃盐酸胍（100 mg·kg-1）。灌胃药物7 d，饥饿12 h，测定空腹血糖值。
       2.3  统计方法用SPSS 13.0 做显著性检验。
       3  结果
       3.1  黄连生物碱及其复合物对HepG2降糖实验结果在没有胰岛素影响的情况下，黄连生物碱及其复合物对HepG2细胞消耗葡萄糖的测定结果表1。表1  黄连生物碱促进HepG2对葡萄糖的消耗量（略）
       从表1中可以看到，与对照相比，在很低的浓度下（0.2 mg·L-1）黄连生物碱就具有促进HepG2消耗葡萄糖的能力；小檗碱促进葡萄糖消耗的能力明显高于药根碱、巴马汀和黄连碱等生物碱，尤其是在高浓度下，这种趋势更加明显；4种黄连生物碱单体促进HepG2消耗葡萄糖的能力依次为：小檗碱〉黄连碱〉药根碱〉巴马汀。
       
       从表1中还可以看到，与单体相比，在同等浓度下，复合物生物碱促进HepG2消耗葡萄糖的能力明显优于黄连生物碱单体，而与小檗碱相当；尤其是在低浓度下，复合物生物碱促进HepG2消耗葡萄糖的能力优于小檗碱等黄连生物碱单体。显示出一定的协同效应［6］。
       
       再将试验分为对照组，胰岛素组以及胰岛素处理后的各个药物组，用胰岛素处理细胞16h后，黄连生物碱及其复合物对HepG2细胞消耗葡萄糖的测定结果见表2。表2  黄连生物碱促进胰岛素处理后HepG2对葡萄糖的消耗量（略）
       从表2中可以看到，在用胰岛素处理HepG2细胞后，黄连生物碱促进HepG2细胞消耗葡萄糖的能力更强。测定结果与未用胰岛素处理的结果类似：小檗碱促进葡萄糖消耗的能力由于其他黄连生物碱，而复合物促进葡萄糖消耗的能力优于黄连生物碱单体。显示出明显的协同作用。
       3.2  黄连生物碱及其复合物对HepG2细胞毒性实验结果黄连生物碱及其复合物的细胞毒性见表3。从表3可以看到药物组与对照组的活细胞数一致，显示并非是通过增加细胞数来提高葡萄糖消耗；并且随着小檗碱的浓度增加，HepG2细胞的存活率下降，表现出一定的细胞毒性；而其他黄连生物碱和黄连生物碱的复合物表现出的细胞毒性就小得多，在试验浓度范围内几乎看不到细胞毒性。表3  细胞毒性（略）
       3.3  糖尿病小鼠的降糖实验结果黄连生物碱及其复合物对糖尿病小鼠的降糖实验结果见表4。表4  黄连生物碱对糖尿病小鼠的降糖结果（略）
       从表4可以看到，二甲双胍、小檗碱、黄连碱、药根碱、巴马汀组和复合黄连生物碱组均具有降糖作用，复合生物碱的降糖作用最强，与阳性药物二甲双胍类似；4个黄连生物碱单体比较，小檗碱的降糖作用最强而与符合生物碱类似，黄连碱和药根碱的降糖作用弱于小檗碱，而比巴马汀的降糖作用强。有关结果与细胞实验的结果类似，也与文献报道类似［9］。
       4  讨论与结论
          
       黄连生物碱及其复合物对HepG2细胞消耗葡萄糖的测定结果表明，小檗碱促进HepG2细胞消耗葡萄糖的能力最强，黄连碱次之，药根碱再次之，巴马汀的作用最弱；动物实验的结果也证明巴马汀的降糖作用最弱，有关研究与文献报道类似［9］。但是，将黄连生物碱复配形成复合物后，复合物促进HepG2消耗葡萄糖的能力明显增加，显示出一定的增效作用。对细胞生长的测定结果表明，小檗碱的细胞毒性较大，浓度超过5 mg·L-1后，即表现出明显的抑制细胞生长的作用，而复合物对细胞生长几乎没有影响。可见，黄连复合生物碱的安全性比小檗碱高，而降糖活性与小檗碱类似甚至更好。显示出黄连复合生物碱在开发降糖产品方面具有比小檗碱更好的前景。
       【参考文献】
         　　［1］Wehad H. Al Tourah.Angiotensin-converting enzyme inhibitors and angiotensin-receptor blockers in prevention of nephropathy and cardiovascular disease in diabetics.Diabetes & Metabolic Syndrome［J］. Clinical Research & Reviews，2008，2： 131.
       
       ［2］钟国跃, 黄小平, 马开森, 等.我国黄连(味连) 质量评价研究［J］. 中国中药杂志.，2005，30(7):594.
       
       ［3］Zhou L, Yang Y, Wang X , et al. Berberine stimulates glucose transport through a mechanism distinct from insulin［J］. Metabolism, 2007, 56: 405.
       
       ［4］Lee YS , Kim WS , Kim KH , et al. Berberine, a natural plant product, activates AMP - activated protein kinase with beneficial metabolic effects in diabetic and insulin - resistant states［J］. Diabetes, 2006, 55:2256.
       
       ［5］谷 卫,曾文衡,胡海英.小檗碱对3T3- L1脂肪细胞脂联素表达的影响［J］. 中国中药杂志, 2005,30:286.
       
       ［6］申竹芳,谢明智. 高效薄层荧光光密度法测定生物样品中的小檗碱含量［J］. 药学学报, 1993, 28(7): 532.
       
       ［7］郭丽民，张汝学，贾正平，等.地黄寡糖对HepG2细胞增殖及胰岛素抵抗的作用［J］. 中国中药杂志，2007，32(13)1328.
       
       ［8］Matsui T, Ueda T, Oki T. a-Glucosidase inhibitory action of natural acylated anthocyanins 1. survey of natural pigments with potent inhibitory activity［J］. J Agric Food Chem,2001, 49(4): 1948.
       
       ［9］郑红艳.原小檗碱类生物碱作用差异的机理研究［D］. 天津大学硕士学位论文，2004.