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       【摘要】 
       目的探讨黄芪多糖是否可以减轻布比卡因对孕鼠脊神经毒性损伤反应及其保护机制。方法健康雌性妊娠17日SD大鼠，体质量350～400 g，取鞘内置管成功孕鼠30只，随机分成5组（n＝6）。对照组（N组），2％和4％布比卡因组（2B组和4B组），2％和4％布比卡因黄芪多糖治疗组（2H组和4H组）。N组：鞘内注射生理盐水30 μl，腹腔注入生理盐水；2B组或4B组：鞘内注入2％或4％布比卡因30 μl，腹腔注入生理盐水；2H组或4H组：鞘内注入2％或4％布比卡因30 μl，腹腔注入黄芪多糖（25 mg/kg，生理盐水稀释成2 ml，连续注药4 d）。鞘内注药后10 min，20 min，30 min，1 h，2 h，4 h，1 d，2d，3 d和4 d测定甩尾反应潜伏期（TFL），用最大效应百分比MPE表示，并进行下肢运动功能（MF）评分。4d后各组大鼠行断颈处死，分离背根神经节，Western blot分析Caspase-9蛋白表达水平和病理学观察。结果各组MPE比较差异有统计学意义（P<0.05）；鞘内注药后10 min， 2B组、4B组、2H组和4H组MPE均达到峰值，2B组和4B组于2 d恢复至基线水平，而2H组和4H组于1 d恢复至基线水平；在鞘内注药1 d，与4B组比较， 2H组和4H组MPE降低（P<0.05）。注入布比卡因后，各组MF评分较N组均明显升高（P<0.05）；2B组和2H组于注药后4 h恢复正常，而4B和4H组于1 d恢复正常。与N组比较， 2B组， 4B组， 2H组和4H组Caspase-9蛋白表达均上调（P<0.05）；与2B组比较， 2H组Caspase-9蛋白表达降低（P<0.05）。病理学结果：2B组和4B组有部分神经细胞萎缩、空泡化；2H组和4H组神经细胞萎缩、空泡化数量明显少于2B组和4B组。结论黄芪多糖对孕鼠布比卡因脊神经毒性损伤反应具有一定保护作用，其机制可能与抑制Caspase-9蛋白表达，抗神经细胞凋亡有关。
       【关键词】  黄芪多糖； 布比卡因； 药物毒性； 妊娠； caspase-9； 凋亡
       Protective Effect of Astragalus Polysaccharides on Neurotoxicity of Intrathecal Bupivacaine in Pregnant Rats
       CUI Rui，XU Shiyuan，WANG Jianxin,LEI Hongyi, CAI Qingxiang
        
       （Department of Anesthesiology，Zhujiang Hospital，South Medical University，Guangzhou 510280，China;  Affiliated Shenzhen Hospital for Women and Children, South Medical University, Guangzhou 518028, China）
       Abstract：ObjectiveTo investigate the protective effect of Astragalus polysaccharides(APS) on intrathecal ( IT ) bupivacaine neurotoxicity in pregnant rats and its mechanism.  MethodsThirty late pregnant rats weighting 350-400 g were used in this study. All the rats in which PE-10 catheter were successfully placed without complication were divided into 5 groups randomly (n=6 each): normal pregnant groups ( group N ), 2％ and 4％ bupivacaine groups ( group 2B, group 4B ) , 2％ and 4％ bupivacaine APS treated group ( group 2H, group 4H ) . Group N: received normal saline 30 μl IT and intraperitoneal injection with normal saline 2 ml. Group 2B or 4B: received 2％ or 4％ bupivacaine 30 μl IT and intraperitoneal injection with normal saline 2 ml. Group 2H or 4H: received 2％ or 4％ bupivacaine 30μl IT and intraperitoneal injection with APS (25 mg／kg , normal saline diluted to 2 ml, continuous injection 4 d). Tail-flick test and motor function were performed at 10min, 20 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 1 d, 2 d, 3 d and 4 d after IT administration. TF latent period was converted to the percent of maximal possible effect (MPE). Four days later, the animals were sacrificed and the DRG were removed for determination of caspase-9 protein expression by western blotting and the pathological changes were observed with light microscope. ResultsAfter the IT 10min, 2B, 4B, 2H and 4H group MPE reached the peak. MPE in group 2B and 4B returned to the baseline values after 2 d, in group 2H and 4H returned the baseline values after IT 1 d. In each group MF score was significantly increased after IT bupivacaine. Group 2B and 2H returned to normal after IT 4 h, then group 4B and 4H returned to normal after IT 1 d. Rats in group 2B, 4B, 2H and 4H significantly increase the expression of caspase-9 in DRG compared with those in group N. Compared with group 2B, rats in group 2H decreased significantly the expression of caspase-9 in DRG. Pathological results showed the neuroval injury in 2B and 4B group was more serious than in 2H and 4H group. Conclusion APS has neuron protection against neurotoxicity of intrathecal bupivacaine in pregnant rats, which is related with down-regulation of caspase-9 expression.
       Key words：APS;  Bupivacaine;  Druy toxicity;  Pregnancy;  Caspase-9;  Apoptosis
       
       近年来，国内外产科病人应用椎管内阻滞的比率逐年增加［1,2］，但有部分产妇应用局麻药进行椎管内阻滞后出现不同程度的神经系统并发症，出现此类并发症的原因可能与局麻药脊神经毒性损伤反应引起的神经细胞凋亡相关［3］。目前，已经发现黄芪多糖可以有效减轻脑再灌注损伤后神经细胞的凋亡［4］。黄芪多糖是否可以减轻局麻药脊神经毒性引起的神经细胞凋亡未见报道。本研究探讨黄芪多糖是否可以减轻布比卡因对孕鼠脊神经毒性损伤反应及其保护机制。
       1  仪器与材料
       1.1  试剂与仪器注射用黄芪多糖（批号：080201，美国泛华医药公司）。盐酸布比卡因分析品，纯度99.9%（批号：014252803，Sigma公司，美国）。兔抗大鼠Caspase-9多克隆抗体（批号：F00037626，Santa Cruz公司，美国）。GAPDH-HRP（批号：KC-5G5，上海康成生物科技有限公司）。PE-10导管（宁波市科技园区安来软件科技有限公司）。鼠尾光照测痛仪（型号：YLS-12A，山东省科学设备站）。
       1.2  动物
       健康雌性SD大鼠，体质量180～220 g，由广东省实验动物中心提供。在室温18～28℃，相对湿度40% ～70%的屏障系统内饲养，不控制饮食，发情期将雌性大鼠和雄性大鼠(比例为5∶1)同笼饲养，每日行阴道涂片，镜下见到精子作为妊娠的第1日。选用妊娠17日孕鼠（体质量350～400 g）为研究对象。
       2  方法
       2.1  鞘内置管 10％水合氯醛（250mg/kg）腹腔注射麻醉，探及脊柱下段的一个钝形突起——髋结节, 其水平位置即为大鼠的L6［5］，于L5～L6椎间隙向头侧置入PE-10导管2 cm。固定导管，埋于皮下。植入过程中见清亮脑脊液从导管内缓慢流出，可证实在蛛网膜下腔。术毕肌注青霉素钠，台灯照射保温1～2 h。大鼠单笼饲养2 d，出现肢体运动障碍的大鼠排除本研究。
       2.2  实验分组和给药取鞘内置管成功孕鼠30只，随机分成5组（n＝6）。对照组（N组），2％和4％布比卡因组（2B组和4B组），2％和4％布比卡因黄芪多糖治疗组（2H组和4H组）。N组：鞘内注射生理盐水30 μl，腹腔注入生理盐水。2B组或4B组：鞘内注入2％或4％布比卡因30 μl，腹腔注入生理盐水。2H组或4H组：鞘内注入2％或4％布比卡因30 μl，腹腔注入黄芪多糖（25 mg/kg，生理盐水稀释成2 ml，连续注药4 d）。各组鞘内注药完毕后，用10 μl生理盐水冲洗导管。
       2.3  MPE的计算测定大鼠热辐射甩尾反应潜伏期(TFL)，将高强度光束照射到鼠尾中下三分之一不同部位，从开始照射到大鼠产生甩尾反应的时间为TFL。如果光照时间到达10 s时，大鼠仍不甩尾，则停止照射，这时TFL记作10 s，连续测定3次，每次间隔15 s，取其平均值。鞘内注药后10，20，30 min，1，2，4，1，2，3 d和4 d测定TFL。TFL用最大效应百分比MPE表示，MPE（%）=(注药后TFL-TFL基础值)／(10-TFL基础值)×100％ 。
       
       2.4  下肢运动功能测定下肢运动功能（Motor function, MF）的评分标准为0∶没有阻滞，1∶部分阻滞，2∶完全阻滞。双下肢的评分相加为测定值。鞘内注药后10 d，20 d，30 min，1 d，2 d，4 h，1 d，2 d，3 d和4 d测定MF。
       2.5  分离背根神经节各组大鼠行断颈处死置于冰块上。将大鼠背毛剪去， 2％碘酊和75％酒精消毒，无菌操作行后背部正中切口，切开皮肤、皮下组织，钝性分离脊柱两旁肌肉，暴露腰底段脊柱棘突与横突，在16×简易手术显微镜下去棘突、椎板及双侧横突，蚊钳咬开椎间孔，剪去背根神经节两端脊神经干，保留膨大部分，即为背根神经节。
       2.6  Western blot分析Caspase-9蛋白表达水平背根神经节加入100 μl蛋白裂解液置于研磨器中匀浆。①蛋白定量。②电泳： 80 V电泳40～50 min，120 V电泳至溴酚蓝线接近胶底。③转印至PVDF膜。④加入Caspase-9多克隆抗体，4℃过夜。⑤加入相应的二抗工作液及内参GAPDH 37℃孵育1 h。⑥显色，照相。⑦应用图像分析软件IPP 6.0分析目标条带，以目标条带光密度值与GAPDH光密度值的比值反映Caspase-9蛋白表达水平。
       2.7  病理组织学观察4 d后SD孕鼠10％水合氯醛腹腔注射麻醉下（250 mg/kg）腹腔注射麻醉后打开胸腔，左心室钝针插管至主动脉起始部，剪开右心耳，依次灌人生理盐水300 ml和4℃的40 g/L多聚甲醛400 ml。取出背根神经节，常规石蜡包埋、切片，厚度4 μm。分别行苏木素-伊红(HE)染色，在100×和400×光镜下观病理变化。
       2.8  统计学数据分析采用SPSS13.0统计学软件进行分析，计量资料以±s表示，组内比较采用重复测量设计的方差分析，组间比较采用单因素方差分析。等级资料以中位数（第10，90位点百分位数）表示，组内和组间比较采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。
       3  结果
          
       各组MPE比较差异有统计学意义（P<0.05）；鞘内注药后10 min， 2B组、4B组、2H组和4H组MPE均达到峰值，2B组和4B组于2 d恢复至基线水平，而2H组和4H组于1d恢复至基线水平；在鞘内注药1 d，与4B组比较， 2H组和4H组MPE降低（P<0.05）；另4B组一只大鼠鞘内注药后出现甩尾反应障碍，4 d后仍未恢复，结果见表1。表1  各组鞘内注药后MPE的比较（略）
       
       实验过程中， N组没有大鼠出现运动功能障碍；注入布比卡因后，各组MF评分均明显升高（P<0.05），2B组和2H组于注药后4 h恢复正常，而4B和4H组于1 d方恢复正常。结果见表2。表2  各组鞘内注药后MF评分的比较（略）
       
       与N组比较， 2B组， 4B组， 2H组和4H组Caspase-9蛋白表达均上调（P<0.05）; 与2B组比较， 2H组Caspase-9蛋白表达降低（P<0.05），见表3。表3  各组大鼠背根神经节内Caspase-9蛋白表达水平的比较（略）
       病理学改变， N组大鼠背根神经节细胞形态和结构正常。2B组和4B组有部分神经细胞萎缩、空泡化。2H组和4H组神经细胞萎缩、空泡化数量明显少于2B组和4B组。
       4  讨论
         
       黄芪多糖(Astragalus polysaccharides，APS)是从中药黄芪中提取纯化的植物多糖，除具有明显的增强免疫功能作用外，研究发现，黄芪多糖还可以通过激活细胞免疫，升高IL-1β水平而促进周围神经损伤后的修复，同时对周围神经再生有一定作用［6］。本研究用黄芪多糖为类白色无定形粉末，无嗅，无味，主要成分为α-1，4(1，6)葡聚糖、阿拉伯－半乳多糖、鼠李－半乳糖醛酸多糖和阿拉伯-半乳蛋白多糖所组成，平均分子质量为2万～6万。本研究采用剂量是根据临床黄芪多糖治疗免疫功能低下所用剂量，并参考相关文献按体表面积系数换算确定的［7］。本研究发现，随着鞘内注入布比卡因浓度的增加，孕鼠感觉、运动神经阻滞持续时间明显延长。对于相同浓度布比卡因，黄芪多糖组孕鼠的感觉神经阻滞时间明显短于布比卡因组孕鼠，而且，黄芪多糖组孕鼠没有出现感觉功能障碍。同时，研究发现黄芪多糖组孕鼠神经细胞萎缩、空泡化数量明显少于布比卡因组。可见，黄芪多糖对孕鼠布比卡因脊神经毒性损伤反应具有一定的保护作用。至于黄芪多糖对本模型孕鼠的运动功能无明显影响，则与单次鞘内注药，孕鼠运动神经阻滞时间较短（2～4 h），腹腔注入黄芪多糖未发挥药理作用有关。
       
       鞘内注入局麻药直接作用于神经细胞，具有直接和间接的神经毒性作用。有研究认为局麻药脊神经毒性损伤机理与细胞凋亡有关［8］。本研究发现，鞘内注入布比卡因后， 2B组， 4B组， 2H组和4H组Caspase-9蛋白表达均上调。这与之前研究结果一致，布比卡因是通过线粒体通路活化Caspase- 9基因诱导大鼠背根神经节细胞发生凋亡（文章待发表）。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶家族(cysteinyl aspartate specific protease，caspase)是细胞凋亡过程中最重要的蛋白酶。氧自由基、钙超载等凋亡刺激因素使线粒体通透性增加，线粒体跨膜电位下降，释放细胞色素C，后者激活Caspase-9基因和下游的Caspase-3基因，诱导细胞发生凋亡［9］。黄芪多糖对孕鼠布比卡因脊神经毒性损伤反应具有一定保护作用与其抗神经细胞过氧化损伤和凋亡作用有密切联系。大量研究发现，黄芪及其提取物黄芪多糖均具有清除自由基，抵抗脂质过氧化反应的作用。同时，也有研究发现黄芪及其提取物黄芪多糖，可以通过抑制核因子-κB，Caspase-3mRNA的表达以及上调Bcl－2蛋白的表达等多种方式减轻神经细胞的凋亡［4，10，11］。本研究结果显示，与2B组比较， 2H组Caspase-9蛋白表达明显降低，可见黄芪多糖是通过降低孕鼠背根神经节细胞Caspase-9蛋白表达，从而发挥抗神经细胞凋亡作用，对布比卡因脊神经毒性损伤反应具有一定保护作用。但4H组Caspase-9蛋白表达降低不明显，可见，黄芪多糖不能逆转由高浓度布比卡因引起的脊神经毒性损伤反应，其主要作用是保护尚未受损或轻度受损的神经细胞。
         
       综上所述，黄芪多糖对孕鼠布比卡因脊神经毒性损伤反应具有一定保护作用，其机制可能与抑制Caspase-9蛋白表达，抗神经细胞凋亡有关。
       【参考文献】
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