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       【摘要】 
       目的研究黄芩苷诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡及对相关蛋白表达的影响。方法采用体外细胞培养方法，应用MTT法检测黄芩苷诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡作用；通过免疫细胞化学(S-P法)检测凋亡相关基因bcl-2、bax、P53蛋白表达的改变。结果MTT结果表明，黄芩苷在体外对人肝癌HepG-2细胞有明显的诱导细胞凋亡作用，且这种抑制作用呈现浓度和时间依赖性。免疫细胞化学(S-P法)检测凋亡相关基因Bcl-2、P53蛋白表达明显减少、Bax表达明显增加；Bcl-2/Bax比例明显降低。结论黄芩苷对人肝癌HepG-2细胞具有较强的诱导凋亡的作用，其作用机制可能与下调P53基因表达和降低Bcl-2/Bax比例有关。
       【关键词】  黄芩苷； 人肝癌HepG-2细胞； 细胞凋亡
       随着分子生物学的不断发展，人们对肿瘤的本质和作用机理方面有了更深层次的阐述，抗癌药物研究水平也不断提高。黄芩苷具有抗脂质氧化，降低血脂、血压和抗炎等药理作用［1，2］。本实验对黄芩苷诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡及其相关蛋白表达进行了初步研究。现报道如下。
       1  材料与仪器
       1.1  细胞株HepG-2细胞购于南京凯基生物技术公司。
       1.2  药物试剂黄芩苷购于南京青泽医药有限公司；噻唑兰购自美国Sigma公司；RPMI1640培养基购自美国GIBCO公司；小牛血清购自北京华美生物工程公司；胰蛋白酶购自美国DIFCO公司；鼠抗bcl-2、bax及P53单克隆抗体购自福建迈新生物有限公司；免疫细胞化学试剂盒（S-P法）购自福建迈新生物有限公司。
       1.3  仪器OLYMPUS倒置显微镜购自日本；RT-2100型酶标仪购自美国；二氧化碳培养箱购自日本HITACHI公司；超净工作台购自上海净化设备厂；PD-2000真彩色病理细胞图像分析仪购自北京天地百年科技公司。
       2  方法
       2.1  HepG-2细胞培养人肝癌HepG-2细胞贴壁生长，培养于含10％灭活小牛血清，含100 U/ml青霉素及100 U/ml链霉素的RPMI1640培养液中，置37℃、相对湿度90%、5% CO2培养箱内培养。
       2.2  MTT比色实验取对数生长期的细胞以每孔105个细胞接种于96孔细胞培养板，每孔培养液200 μl，按照所需要的黄芩苷浓度（终浓度分别为：25，50，100 μg/ml）接种于细胞培养板（瓶），每个药物浓度设4个平行复孔，与试验孔平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔，另设只加细胞不加药物的阴性对照组，继续培养24，48，72 h后每孔加入 5 mg/ml MTT溶液20 μl，继续培养4 h后终止培养，小心吸弃孔内上清液，每孔加入DMSO 150 μl，振荡混合仪振荡10 min，使结晶充分溶解，选择 492 nm波长酶标分析仪测定每孔光吸收值（A值），计算细胞生长抑制率。
       
       抑制率(%)=（对照孔A值-实验孔A值）/对照孔A值×100%
       2.3  免疫细胞化学染色法
       2.3.1  爬片的制备取对数生长期的HepG-2细胞，调整细胞浓度，以1×105个/ml的浓度接种于放有多聚赖氨酸预处理的盖玻片的无菌6孔培养板，每孔2 ml。在5%CO2饱和湿度环境下培养细胞24 h，待细胞贴壁生长良好，吸除上清液，实验组加入黄芩苷，终浓度为50 μg/ml，对照组加等量的生理盐水，继续培养48 h后取出细胞爬片进行免疫细胞化学实验。
       2.3.2  免疫细胞化学测定取出药物处理后的HepG-2细胞爬片，95%乙醇室温固定30 min；3%H2O2-甲醇，室温孵育20 min，消除内源性过氧化物酶活性；0.1%Tritonx-100室温孵育30 min，利于抗体进入细胞；10%正常山羊血清室温孵育20 min，封闭非特异性抗原；倾去血清，加入50 μl一抗，使其完全覆盖细胞，置于湿盒内，4℃过夜；加入50 μl二抗，37℃，40 min；加入50 μl 三抗，37℃，20 min；DAB显色，显微镜下观察，至阳性显色明显时用自来水冲洗，逐级脱色、透明、中性树胶封片。
       2.3.3  结果判断在高倍镜下，每例随机选取5个阳性细胞密度最高的部位，通过真彩色病理细胞图像分析系统，取其平均值作为凋亡相关基因蛋白的阳性表达率。
       2.4  统计学处理使用SPSS11.5统计软件，完全随机分组实验所得数据的计量资料采用t检验。完全随机分组实验所得数据的计数资料和率的比较采用χ2检验。
       3  结果
       3.1  MTT比色实验不同处理组分别培养24，48，72 h，黄芩苷对HepG-2细胞生长有抑制作用，并且随着时间的延长和药物浓度的增加，黄芩苷对HepG-2细胞的抑制效果越明显，药物对肿瘤细胞生长有量-效、时-效关系。结果见表1～2。当黄芩苷浓度为50 μg/ml，作用时间为48 h时，对HepG-2细胞的抑制率为51.241%，接近半数抑制浓度(IC50)。故以后进行的所有实验中黄芩苷的终浓度为50 μg/ml，作用时间48 h为基准设定实验分组并观察各种结果。表1  黄芩苷对肝癌HepG-2 细胞的抑制作用，表2  黄芩苷对肝癌HepG-2 细胞的抑制率(略)
       3.2  黄芩苷对HepG-2细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax、p53蛋白表达的影响结果见图1～3及表3。Bcl-2蛋白主要定位于细胞浆。实验结果显示，对照组细胞胞浆染色细胞数量多，且呈棕黄色，而加药组阳性细胞数明显减少，染色变浅，阳性表达率与对照组相比差异有显著性（P<0.01）。Bax蛋白主要定位于细胞浆，染色呈棕黄色。实验结果显示，对照组胞浆染色细胞数量少，而加药组阳性细胞数明显增多，染色加深，阳性表达率与对照组相比差异有显著性（P<0.01）。P53蛋白主要位于细胞核，染色呈深棕色。实验结果显示，对照组胞核染色细胞数多，而加药组阳性细胞数明显减少，染色明显变浅。加药组阳性表达率与对照组相比差异有显著性（P<0.01）。表3  黄芩苷对Bcl-2, Bax和P53蛋白表达的影响(略)
       4  讨论
          
       细胞凋亡的现象广泛存在于肿瘤的发生发展过程中，是细胞损伤的特征性病理生理变化，干预细胞凋亡来治疗肿瘤已成为当今肿瘤药理的一个新的发展方向。
       
       Bax自身形成同源二聚体。当细胞内Bcl-2较多时，Bcl-2和Bax的异源二聚体增多，凋亡趋势减弱：当细胞内Bax较多时，则Bax本身形成的同源二聚体占主导，易于发生凋亡。Bcl-2和Bax的基因产物相互作用，形成同二聚体或异二聚体，它们之间的比例影响着肿瘤细胞对各种凋亡刺激因子的敏感性和抗性，最终决定细胞的生存或死亡，两者的比例是决定细胞是否凋亡的关键。P53可通过Bax/Bcl-2和Fas/Apo1等蛋白调节细胞凋亡的进程。胞浆内P53的积聚可直接激活Bax，改变线粒体膜的通透性，促进细胞色素C的释放，诱导细胞凋亡，P53的功能类似于Bcl-2家族的BH3亚系中Bid等，可直接作用于Bcl-xL促使Bax的释放和激活［3，4］。已有的研究提示，黄芩苷的药理作用可能与Bcl家族P53，Fas等调控因子有关［5～7］。
       
       本实验研究中通过观察黄芩苷诱导人肝癌HepG-2细胞的凋亡作用，从形态学和分子水平探讨了其可能的机制，认为黄芩苷诱导人肝癌HepG-2细胞的凋亡可能与黄芩苷下调了mtp53的表达和上调Bax/ Bcl-2比值，但本实验仅对黄芩苷抑制肝癌细胞的作用作了初步探讨，并且也只是定性方面的研究，定量方面的作用机制尚待进一步研究。
       【参考文献】
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