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       【摘要】 
       目的探讨中药金叶败毒制剂（简称中药）对人巨细胞病毒（HCMV）感染人胚肺成纤维细胞（HEL）细胞病变及细胞周期的影响。方法用HCMV AD169感染人胚肺成纤维细胞，分别用金叶败毒制剂和更昔洛韦（简称GCV）干预后，用倒置相差显微镜观察不同感染时间细胞病变，并采用流式细胞技术检测HCMV感染及药物干预后宿主细胞周期。结果金叶败毒制剂能明显抑制HCMV感染HEL细胞病变。中药干预组在病毒感染48 h后，HEL细胞处于G2/M期的细胞明显增多,在HCMV感染72 h后，药物干预组 HEL细胞均表现为S期细胞明显减少，G2/M期和G0/G1期细胞明显增多。结论金叶败毒制剂可能通过延缓HCMV感染细胞病变，促进细胞周期进程而发挥抗病毒作用。
       【关键词】  金叶败毒制剂； 人巨细胞病毒； 细胞病变； 细胞周期
       Effect of Jinye Baidu Preparation on Cell Pathological Change and Cell Cycle of Human Embryonic Lung Fibroblast Cells Infected by Human Cytomegalovirus
       YUAN Hui，WEN Liangzhen
        
       （Medical College，Jianghan University，Wuhan 430056,China；Department of Gynecology and Obstetrics, Tongji Hospital, Tongji Medical College，Huazhong University of Sciences and Technology, Wuhan  430030,China）
       Abstract：ObjectiveTo study the effect of Jinye Baidu Preparation (JBP)，a Chinese medicinal preparation, on the cell pathological change and cell cycle of human embryonic lung fibroblast cells(HEL) infected by human cytomegalovirus (HCMV).
       MethodsThe HEL cells were infected by HCMV AD169, the pathological change of the infected cells during different infected time was observed by inverted contrast microscope before and after intervention of JBP and GCV. The cell cycle was detected in the HEL and the infected cells before and after intervention of medicine by the Flow Cytometer. ResultsJBP showed obviously inhibitory action on cell pathological change in the HCMV infected cells. The infected cells in G2/M phase were obvious increased 48 hours after HCMV infection after intervention of JBP. The infected cells in S phase were obviously reduced, and in G2/M phase and in G0/G1 phase they were obviously increased 72 h after HCMV infection after intervention of JBP.ConclusionJBP can delay cell pathological change of the HCMV infected cells, advance the cell cycle process so as to achieve the anti-virus action.
       Key words： Jinye Baidu Preparation；Human cytomegalovirus；Cell pathological change；Cell cycle
         
       人巨细胞病毒（HCMV）是目前引起宫内感染的重要病原体之一，HCMV宫内传播与异常妊娠结局（流产、死胎、畸形、胎儿生长受限等）的发生关系密切，已成为影响胎儿发育的常见原因［1］。由于妊娠期HCMV感染尚无有效的治疗药物，本课题组在对金叶败毒制剂和巨细胞病毒感染的长期研究中发现，该中药制剂在体内外对HCMV均有明显的抑制作用［2，3］。本研究采用倒置相差显微镜动态观察感染细胞病变及流式细胞检测技术，探讨中药金叶败毒制剂对HCMV感染的人胚肺成纤维细胞（HEL）的细胞病变及细胞周期的影响，为临床用药提供实验依据。　
       1  材料与仪器
       1.1  药物金叶败毒制剂主要成分为金银花、鱼腥草、大青叶及蒲公英等，20 ml/支，每毫升含生药量1 g，批号：950430，由同济医院中西医结合研究所提供,临用时用细胞维持液（含3%DMEM）稀释成不同浓度的溶液。更昔洛韦（简称GCV）粉针剂，25 mg/支，批号：950101，购自湖北省医学工业研究所,临用时用细胞维持液稀释成不同浓度的溶液。
       1.2  细胞和病毒人胚肺成纤维细胞(HEL)由同济医院围产实验室提供,按常规方法培养、传代，制成单层细胞,第10～20代用于本实验。HCMV AD169标准毒株由湖北省病毒研究所提供，按常规方法传代、滴定,并测定半数组织培养感染量TCID50。
       1.3  试剂及仪器高糖DMEM培养基，胰酶，胎牛血清等为Promega公司产品，碘化丙啶（PI）染色液为Sigma公司产品。
         
       仪器： 流式细胞仪FACStar由美国BD公司提供。
       2  方法
       2.1  病毒感染性滴度的测定胰蛋白酶消化收集HEL细胞，用10% DMEM培养液配制细胞悬液，0.4%台盼蓝染色后计数活细胞数，调整细胞浓度为 1×104个细胞/ml，接种于 96 孔细胞培养板内，0.2 ml/孔，待细胞长成单层后，同步化12 h；分别接种不同稀释度（10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，10-9）的AD169病毒，每个稀释度设8孔，每孔25 μl，37℃，5% CO2 培养箱吸附1.5 h后，弃上清，加维持液0.1 ml/孔，同时设细胞对照孔8孔；置37℃，5% CO2 培养箱培养，每日检查病毒生长情况，观察并记录特征性细胞病变（CPE）的孔数，7～28 d后记录结果。按Reed-Muench法［4］计算病毒的半数感染量（TCID50）。
       2.2  金叶败毒制剂对HCMV感染细胞病变的抑制作用以第10～20代HEL细胞为实验材料，接种于100 ml方培养瓶中，待细胞长成单层后，将100TCID50 的AD169毒株接种于培养瓶中，37℃吸附1.5 h后换液，病毒对照组更换维持液（DMEM-3%FCS）；药物实验组更换用维持液稀释的金叶败毒制剂,终浓度为4 mg/ml；药物对照组更换用维持液稀释的GCV, 终浓度为25 μg/ml。以上各药物及对照组均设3个实验瓶,倒置相差显微镜连续观察各组细胞病变，分别记录感染后12，24，48，72，96，120，144 h细胞病变情况。细胞病变分为: “-”为细胞无病变, “+”为1%～25%细胞病变, “++”为26%～50%细胞病变, “+++”为51%～75%细胞病变, “++++” 为76%～100%细胞病变。
       2.3  流式细胞术检测细胞周期取第10～20代生长良好的HEL细胞，接种于100 ml方培养瓶中，待细胞长成单层后，同步化12 h。将100TCID50 的AD169毒株接种于培养瓶中，按上述方法处理细胞和分组，同时设细胞对照组，每组均设3个实验瓶。分别于感染后24，48，72，96 h终止培养，用含0.25%胰蛋白酶消化细胞，制成单细胞悬液后用预冷的PBS漂洗两次，800 r/min离心5 min, -20℃预冷的70%乙醇固定（-20℃）24～48 h。PBS洗涤，离心后去除固定液，加碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色液（含50 mg/L PI，0.1%Triton X-100, 100 mg/L Rnase A）避光染色30 min后，在流式细胞仪FACStar(美国BD公司)上进行细胞周期分析。
       2.4  统计学处理数据以±s表示，采用SPSS 11. 5 统计软件包进行t检验。
       3  结果
       3.1  HCMV病毒感染性滴度不同滴度下，病毒感染的判断。结果见表1。该病毒的滴度（TCID50）为10-3.614。表1  病毒感染性滴度测定（略）
       3.2  金叶败毒制剂对HCMV感染细胞病变的抑制作用在HCMV感染12 h后就可观察到少许细胞病变，即细胞变大，细胞核及细胞质内可见病毒包涵体，见图1。随病毒感染时间的延长细胞病变不断加重，在病毒感染48 h，细胞病变为“+”，感染168 h后全部细胞发生病变；而金叶败毒制剂组和GCV组在病毒感染72 h后才出现细胞病变，并且进展缓慢，感染168 h后细胞病变仅为“++”,明显轻于病毒对照组。结果见表2。表2  不同感染时间各组细胞病变的比较（略）
       3.3  金叶败毒制剂对HCMV感染HEL细胞周期的影响
       
       由表3可见，在HCMV感染24 h后，宿主细胞处于S期的细胞增多，明显多于细胞对照组，病毒感染48 h后，宿主细胞处于G2/M期的细胞明显少于细胞对照组；与细胞对照组比较，自HCMV感染96 h后，随着感染时间延长，宿主细胞均表现为S期细胞明显增多，G2/M期细胞明显减少，而G0/G1期细胞亦明显少于细胞对照组，见表4。由表3～4可见，经金叶败毒制剂干预后，在HCMV感染24 h后，宿主细胞处于S期细胞明显少于病毒对照组，病毒感染48 h后，宿主细胞处于G2/M期的细胞明显多于病毒对照组；与病毒对照组比较，在HCMV感染72 h后，宿主细胞均表现为S期细胞明显减少，G2/M期细胞明显增多，而G0/G1期细胞亦明显增多。表3  各组感染24 h及48 h与对照组HEL细胞周期分析，表4  各组感染72h及96h与对照组HEL细胞周期分析(略)
       4  讨论
         
       中药金叶败毒制剂是同济医院中西医结合研究所研制的一种纯中药制剂，其主要成分为金银花、鱼腥草、大青叶、蒲公英等，经三十余年的基础研究和临床应用证实该药具有抗HCMV及提高机体免疫功能作用［5］，临床使用前的毒性实验和安全性实验均为阴性。
        本研究发现，在HCMV感染12 h后就可观察到少许细胞病变，即细胞变大，细胞核及细胞质内可见病毒包涵体。随病毒感染时间的延长细胞病变不断加重，在病毒感染48 h，细胞病变为“+”，感染72h细胞病变为“++”，病毒感染168h后全部细胞均发生病变。经金叶败毒制剂和GCV干预后，在病毒感染72 h后细胞病变为“+”，并且进展缓慢，感染168 h后细胞病变仅为“++”,明显轻于病毒对照组。表明金叶败毒制剂能明显抑制HCMV引起的细胞病变，与GCV有相近的抗病毒能力。
       
       HCMV的复制需广泛地改变细胞代谢，造成细胞许多生理改变及基因的活化，HCMV感染能使处于G0/G1期的细胞达到或接近G1/S限制点，对S期感染则导致细胞周期阻滞。处于不同细胞周期的细胞感染HCMV，皆可导致细胞周期的改变，在G0/G1期感染可导致细胞周期进展到G1/S限制点，对S期感染则导致细胞周期阻滞，细胞将不能进行有丝分裂细胞［6］。Barsukova［7］等用HCMV感染二倍体纤维母细胞，在S期感染引起细胞周期进展停滞。本作者在前期的研究中证实中药金叶败毒制剂可促进HCMV感染细胞cyclinD1和CDK4的高表达，诱导宿主细胞通过G1/S调控点，促进细胞周期进程［8］。
       
       本研究采用流式细胞技术，对HCMV感染人胚肺成纤维细胞进行细胞周期分析，结果显示，在HCMV感染24 h后，宿主细胞处于S期的细胞明显多于细胞对照组，HCMV感染96 h后，宿主细胞均表现为S期细胞明显增多，G2/M期细胞明显减少，而G0/G1期细胞亦明显减少。该结果表明，在HCMV感染早期，HCMV可促使G0/G1期细胞进展到G1/S限制点，使处于S期细胞增多，在S期细胞感染HCMV则可导致细胞周期阻滞，细胞将不能进行有丝分裂，使大量细胞停留在S期，不能顺利返回到G0/G1期，这与文献报道的结果相符［6］。经金叶败毒制剂干预后，在HCMV感染24 h后，宿主细胞处于S期细胞明显减少，在HCMV感染72 h后，处于S期细胞明显减少，处于G2/M期和G0/G1期细胞均明显增多。该研究结果表明，金叶败毒制剂可促进HCMV感染HEL细胞从S期进展到G2/M期，药物干预后G0/G1期增多表明该药物可促进病毒感染细胞有丝分裂并顺利返回到G0/G1期。
       
       上述研究结果表明，金叶败毒制剂能明显抑制HCMV引起的细胞病变，促进HCMV感染细胞细胞周期的进程。本研究在一定程度上揭示了该中药的抗病毒作用机制，为临床进一步推广应用该药物治疗HCMV感染提供一定的理论依据。
       【参考文献】
         　　［1］王志新，闻良珍，曾万江，等.巨细胞病毒宫内感染对胎婴儿生长发育的影响［J］.中华妇产科杂志，1996，31（7）：412.
       
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       ［8］袁 慧，刘世新，闻良珍，等. 中药金叶败毒制剂抗人巨细胞病毒感染的作用机制［J］.华中科技大学学报（医学版），2005，34（3）：345.