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       【摘要】 
       目的观察经前舒颗粒对大鼠海马神经元ERβ蛋白和基因表达的影响，探讨经前舒颗粒治疗经前期综合征（PMS）肝气郁证的作用机制。方法 以束缚造模法复制PMS肝气郁证大鼠模型，给药组给予调肝方药经前舒颗粒，模型组给予灭菌饮用水，并设不造模正常组，取各处理组血清，对体外培养大鼠海马神经元细胞进行干预；采用蛋白质印迹技术（Western blot，WB）和半定量RT-PCR技术分别对各组细胞ERβ蛋白和基因表达变化进行检测。结果模型组血清能显著升高大鼠海马神经元ERβ蛋白和基因表达水平，western blot 和RT-PCR检测结果均显示经前舒颗粒含药血清能显著改善PMS肝气郁证模型血清干预的大鼠海马神经元ERβ蛋白和基因表达水平异常升高的状况。结论大鼠海马神经元中的ERβ是调肝方药经前舒颗粒的作用靶点之一，经前舒颗粒可能通过降低ERβ蛋白和基因的表达水平而发挥治疗作用。
       【关键词】  PMS肝气郁证； 含药血清； 神经元细胞； 雌激素受体β
       Effect of Jingqianshu on  ERβ Protein and Gene Expression in Rat Hippocampal Nearonal Cells
       LIU Wenwen, XUE Ling
       (Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250355, China)
       Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of Jingqianshu granule on ERβ protein and gene expression in rat hippocampal neurons and the pathogenesis of PMS with liver-"qi" depression. MethodsPrepare Jingqianshu medicated serum intervene and in  vitro culture hippocampal primary neurons ;then detect the variety of ERβ protein and gene expression with WB and RT-PCR respectively. ResultsThe results of WB and PT-PCR revealed that Jingqianshu granule could improve the abnormal conditions of the expression.ConclusionThe Jingqianshu granule can down-regulate the ERβ protein and gene expression levels in neurons, which may be one of the mechanism to treat PMS with liver-"qi" depression.
       Key words： Liver-"qi" depression;  PMS;  Medicated serum;  Neural cells;  Estradiol Receptor beta
         
       经前期综合征（premenstrual syndrome，PMS）肝气郁证是指严重影响正常生活的一组与月经周期密切相关、可预见的经前症状，其主要症状为易激惹、焦虑、抑郁等情绪不稳定的主观症状，其特点为黄体期（月经周期最后两周内）出现症状，月经来潮后症状自行消失［1，2］。PMS肝气郁证是PMS的主要亚型，是肝疏泄不及的表现。经前舒颗粒含白芍、当归、柴胡、白术、丹皮、香附等中药组分具养肝解郁。理气消胀功效，可显著提高PMS肝气郁证临床治愈率。本实验制备大鼠含药血清，并通过Western blot和半定量RT-PCR技术研究了经前舒颗粒含药血清对体外培养大鼠海马神经元ERβ蛋白和基因表达的影响。
       1  材料与仪器
       1.1  药物经前舒颗粒（秦皇岛市山海关制药厂生产 批号：Z20053087），灌胃给药，给药量为4.8 g/kg（相当于人临床8倍剂量）。
       
       1.2  动物健康SD雌性大鼠，体质量180～220 g，36只;新生SD大鼠（24 h）,均由山东中医药大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK（鲁）20050015。
       1.3  试剂Neurobasal、B27、L-Glutamine（Gibco公司提供)；Fetal Bovine Serum、Poly-D-lysine（Sigma公司提供）；Rabbit polyclonal to ERβ IgG（ab3576），碱性磷酸酶标记羊抗鼠IgG（sc-2005）（Santa Cruz公司）；Donkey polyclonal to Rabbit IgG (HRP)(ab16284)， HRP 标记山羊抗小鼠 IgG（SB100-晶美生物）；RNAisoTMPlus、Taq HS（不含dNTP Mixture）、Rnase Inhibitor、dNTP Mixture、RT反转录试剂盒（宝生物工程大连有限公司提供）；引物：ERβ上游F5′-TCA CCG TCG AGC CTT AGT TC -3′下游R5′-TCT GCA TAG AGG AGC GAT GA -3′（286bp）；内参β-actin 上游F5′-AGG GAA ATC GTG CGT GAC-3′下游R5′- CAA AGA AAG GGT GTA AAA CG -3′（552bp）（济南博亚生物工程技术服务有限公司合成）。
       1.4  仪器CO2培养箱（上海力新有限公司）；倒置显微镜（中国重庆光电有限公司）；TECAN酶标仪（上海麦莎生物科技有限公司）；721分光光度计（上海精密仪器仪表有限公司）；凝胶成像分析仪（上海复日科技有限公司）；PCR扩增仪（TAKARA）。
       2  方法
       2.1  含药血清的制备筛选动情周期规则的SD大鼠36只进入实验，并随机分为正常组，模型组和给药组，每组12只，饲养于昼夜颠倒环境。根据文献方法［3］并加以改进，将拟造模大鼠（模型组和给药组）前足与对侧后足用无菌纱布捆缚，妨碍其自由活动，以大鼠稍能活动、取食为度。造模同时给药组大鼠给予经前舒颗粒（1 ml/100 g体质量，相当于人临床8倍剂量［4］）。模型组、正常组大鼠给予相同体积的灭菌饮用水，1次/d，连续5 d。造模完毕断头取血，离心，收集血清，-70℃保存。用前56℃、30 min灭活，0.45 μm微孔滤膜滤菌。
       2.2  大鼠海马神经元培养及细胞相对活力测定参考文献方法［5］，取新生SD大鼠大脑海马区进行神经元体外原代培养，MTT检测神经元存活率。将细胞接种在96孔板中，种植浓度1×106/ml，置于37℃、5% CO2培养箱中培养，分别在培养24，48 h后全量换液。细胞分3组，分别加入正常组大鼠血清、 模型组大鼠血清、 给药组大鼠血清，使其最终浓度为10%（V/V）。细胞培养72h后，每孔加入20 μl 0.5%MTT溶液；继续培养4 h，去上清，每孔加入150 μl DMSO，置培养箱15 min；用酶标仪于490 nm波长测定各孔吸光度值。细胞培养分组及加入大鼠血清（同前），继续培养24 h，消化收集对数生长期细胞，PBS 洗涤，-70℃放置备用。
       2.3  蛋白质免疫印迹技术（Western blot）检测大鼠海马神经元中ERβ蛋白表达水平取细胞样品提蛋白， 检测蛋白含量。进行SDS-PAGE, 用水浴式电转仪将凝胶上的蛋白质转印至NC膜上(1 h)，用含5％脱脂奶粉的TBST室温封闭1 h，然后分别与一抗于4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h，BeyoECL Plus A液和B液显色，曝光，对ERβ表达情况进行检测。显色过的NC膜用洗脱液室温洗脱15 min，再用β-Actin抗体染色并检测（检测均采用Smartview生物电泳图像分析系统）。
       2.4  半定量RT-PCR技术检测大鼠海马神经元中ERβ mRNA的表达水平根据RNAisoTMPlus总RNA提取试剂盒操作说明提取总RNA,紫外分光光度仪检测纯度，A260/A280≈1.8，反转录（RT）按照Promega的反转录试剂盒进行操作，PCR扩增条件为：95℃，3 min，预变性；94℃，30 s，变性； ERβ 62℃，内参61.8℃，45 s,退火；72℃，1 min，延伸；再72℃，7 min，延伸。循环参数为：ERβ为33，内参为25。PCR产物于2%琼脂糖凝胶电泳，应用Smartview生物电泳图像分析系统进行光密度扫描。
       2.5  统计方法利用SPSS 11.5统计软件进行单因素方差分析及LSD法检验以统计数据，所有数据均用±s表示，显著性水平为P<0.05。
       
       3  结果
       3.1  经前舒颗粒含药血清对大鼠海马神经元细胞活力的影响结果见表1。结果表明给药24 h后，与正常组相比，模型组神经元MTT值显著增加（P<0.05）；给药48 h后，与模型组相比，给药组神经元MTT值显著增加（P<0.05）。表1  不同实验组血清处理24h、48h后对大鼠海马神经元细胞相对活力影响（略）
       3.2  经前舒颗粒含药血清对大鼠海马神经元ERβ蛋白表达的影响结果见图1及表2。结果显示，与正常组相比，模型组大鼠血清干预的大鼠海马神经元ERβ的蛋白表达水平显著升高（P<0.05），调肝方药经前舒颗粒含药血清的干预能显著改变ERβ蛋白表达水平异常升高的状态。表2  大鼠海马神经元ERβ与内参相对光密度（略）
       3.3  经前舒颗粒含药血清对大鼠海马神经元ERβ mRNA表达的影响结果见图2及表3。结果显示，与正常组相比，模型组大鼠血清干预的大鼠海马神经元ERβ mRNA表达水平显著升高（P<0.05），调肝方药经前舒颗粒含药血清的干预能显著改变ERβ mRNA表达水平异常升高的状态。表3  大鼠海马神经元细胞ERβmRNA扩增产物与内参相对光密度（略）
       4  讨论
         
       雌激素受体（ER）是核受体超家族的成员，是一类配体调节的转录因子，存在ERα和ERβ两种亚型，ERβ在体内分布广泛，在许多组织和细胞中都有分布［6］。研究发现在脑的许多部位如视觉前区、大脑皮质、丘脑、垂体和边缘系统等都存在着雌激素受体，在脑功能中起重要作用［7～10］,β受体主要分布于大脑皮层、海马处，与记忆、认知和行为有关［10，11］。海马是边缘系统的重要组成部分，对情绪、学习和记忆、行为等的调节起重要作用，也是应激反应的高位调节中枢，慢性应激可损害海马，引起其结构和功能的变化［12，13］。抑郁症患者海马体积萎缩可能与出现认知，情感等方面的症状有关［14］。因此，海马是调节情绪的重要脑区，也是应激损伤的主要易感部位。
       
       本实验采用束缚法制作PMS肝气郁证大鼠模型，在检测方面利用蛋白质印迹技术（Western blot，WB）和半定量的RT-PCR技术对大鼠海马原代神经元中的雌激素受体β蛋白和mRNA表达进行测定，利用ERβ蛋白和mRNA表达量的变化来探讨雌激素受体与PMS肝气郁证的关系。结果表明，与正常组细胞相比，模型大鼠血清干预的海马神经元ERβ蛋白和mRNA表达均显著升高（P<0.05），这说明PMS肝气郁证模型大鼠海马神经元ERβ蛋白和mRNA表达量显著性上调可能是导致经前抑郁的重要病因之一，此病证与脑区ERβ蛋白和mRNA表达量的变化密切相关，这一发现无疑为我们研究经前抑郁的病因提供客观理论与实验依据。而与模型组细胞相比，调肝方药经前舒颗粒含药血清的干预能显著改变ERβ蛋白和mRNA表达水平异常升高的状态，这提示我们经前舒颗粒治疗PMS肝气郁证与调节中枢海马神经元中ERβ蛋白和mRNA表达水平密切相关，虽然目前其具体作用机制尚不清楚，需要进一步研究，但这为经前期综合征肝气郁证的治疗提供了可靠的实验依据。
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