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       【摘要】 
       目的优选了哥王中西瑞香素的最佳提取工艺。方法以西瑞香素含量为考察指标，采用L9（34）正交设计的方法优选了哥王中西瑞香素的最佳提取条件。结果了哥王中西瑞香素的最佳提取工艺为：75%乙醇加热回流提取4次，2 h/次。结论此提取工艺简便合理可行，适用于了哥王中西瑞香素的提取。
       【关键词】  了哥王； 西瑞香素； 正交设计； 提取工艺
       了哥王学名南岭荛花Wikstroemia indica (L.)C. A. Mey，为瑞香科荛花属植物，其根、茎叶和果实均可入药，盛产于广东、浙江、广西等地。了哥王始载于《岭南采药录》，其性味苦寒，微辛，有毒，入肺肝经，具有清热解毒、消肿散结、通经利水等功效。了哥王主要有香豆素类、黄酮类、木脂素类、挥发油类、甾体类、皂苷等成分，文献报道具有抑菌、抗病毒、抗炎镇痛、止咳祛痰、抗癌等作用［1］。西瑞香素（daphnoretin）为香豆素类化合物，在了哥王中含量较大［2］，具有抗病毒［3］、抗肿瘤［4］等作用。了哥王中西瑞香素的提取，文献中采用甲醇为提取溶剂，但甲醇毒性较大，且提取工艺未经优化［5，6］。本实验采用乙醇提取，通过正交实验考察了影响西瑞香素提取工艺的乙醇体积分数、提取时间、提取次数，优选了哥王中西瑞香素的最佳提取工艺，为工业化生产提供实验参考依据。
       1  仪器 试剂与药材
       1.1   仪器岛津LC-6A 高效液相色谱仪（日本SHIMADZU），ANASTAR 色谱工作站（天津奥特塞恩斯仪器有限公司），分析天平（十万分之一，湘仪天平仪器厂），旋转蒸发器（RE-52AA，上海亚荣生化仪器厂），SHZ-Ⅲ型 循环水真空泵（郑州长城科工贸有限公司），KQ-100 超声机（昆山市超声仪器有限公司），恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）。
       1.2   试药西瑞香素对照品（广州来普达克生物技术有限公司，纯度为98.9%），了哥王（购自河北安国市童铃药材有限公司，产地是广东，批号：080522）；甲醇（色谱纯，山东禹王实业有限公司禹城化工厂），纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司），无水乙醇、磷酸为分析纯；了哥王药材由沈阳药科大学孙启时教授鉴定为Wikstroemia indica (L.)C. A. Mey。
       2  方法与结果
       2.1  西瑞香素的含量测定
       
       2.1.1  色谱条件与系统适用性试验色谱柱：Diamonsil C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm)；流动相：甲醇-0.05%磷酸水溶液(49∶51，V/V)；流速1.0 ml·min-1；检测波长：345 nm；柱温：40℃。在上述色谱条件下，理论板数按西瑞香素计不低于3 000。西瑞香素与相邻峰的分离度均大于1.5，拖尾因子均在0.95～1.05之间。色谱图见图1。
       2.1.2   对照品溶液的制备 
       取西瑞香素对照品约5.0 mg，精密称定，置于100 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得50.0 μg·ml-1储备液。
       2.1.3  供试品溶液的制备取了哥王药材约10 g，精密称定，置于圆底烧瓶内，加75%乙醇浸泡过夜，药材∶溶剂=1∶10，次日于80°水浴中回流提取4次，2 h/次，热滤，合并滤液，减压蒸干，所得浸膏用甲醇溶解并转移至100 ml量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取1 ml于50 ml量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 μm滤膜过滤，取续滤液即得。
       2.1.4  标准曲线绘制依次精密吸取西瑞香素标准储备液0.4，0.8，1.6，2.4，3.2，4.0 ml，分别置于10 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配成西瑞香素浓度分别为2.0，4.0，8.0，12.0，16.0，20.0 μg·ml-1的系列标准溶液。吸取20 μl上述溶液依次注入高效液相色谱仪中，于345 nm波长处测定峰面积。以西瑞香素标准溶液的浓度(μg·ml-1)为横坐标(X)，峰面积(A)为纵坐标(Y)，进行线性回归。所得回归方程为Y = 6.183×104 X + 5.492×103， r = 0.999 9 (n = 6)。结果表明，西瑞香素在2.0 ～ 20.0 μg·ml-1范围内呈良好的线性关系。
       
       2.1.5  精密度实验 
       取同一对照品溶液，按上述色谱条件，重复进样6次，20 μl/次。测定西瑞香素峰面积，其RSD为1.1%，表明该方法的精密度良好。
       2.1.6  稳定性实验
       取同一供试品溶液，分别于0，2，4，8，16，24 h按上述色谱条件，进样20 μl测定西瑞香素峰面积，RSD为1.6%，表明西瑞香素在24 h内稳定。
       2.1.7  重复性实验
       精密称取了哥王药材6份，按“2.1.3”项下方法制备并测定，RSD为1.7%，表明此方法的重复性良好。
       2.1.8  加样回收率实验 
       称取已知含量的了哥王药材6份，每份约5 g，精密称定，分别定量加入西瑞香素对照品约20 mg，按“2.1.3”项下方法操作，计算回收率。平均回收率为98.3%，RSD为1.7% 。
       2.2  提取工艺的优化
       2.2.1  正交实验设计
       考虑到大量提取时的实际条件，在预实验的基础上，选取提取溶剂的加入量为药材的10倍量，影响了哥王中西瑞香素提取率的主要因素为：乙醇的体积分数、提取时间、提取次数。因此选取上述3个因素为考察因素，每个因素设立3个水平（见表1）采用L9（34）正交设计表，以西瑞香素含量为指标进行实验，实验安排及结果见表2～3。表1  因素水平，表2  正交实验直观分析结果，表3  方差分析结果（略）
       2.2.2    实验方法及结果 
       称取了哥王药材9份，每份约10 g，精密称定，按表2的设计浸泡过夜后回流提取，热滤，合并滤液，减压浓缩至干，所得浸膏用甲醇溶解，转移至100 ml量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取1 ml置50 ml量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm滤膜过滤，取续滤液按西瑞香素含量测定项下测定。9次实验结果见表2。
       2.2.3  正交实验结果分析由表2～3可知，直观分析表明，各因素对西瑞香素含量影响程度依次为：A>C>B，最佳的工艺组合为A2B2C3 。方差分析的结果表明，3个因素对西瑞香素含量影响均不显著。以西瑞香素含量为主要考察指标，确定最佳提取工艺为A2B2C3 ，即75%乙醇，提取4次，2 h/次。
       2.2.4   方法验证实验根据上述结果筛选的工艺进行实验，平行做6份，按照“2.1.3”项下制备供试品溶液，取20 μl续滤液进样分析。结果：平均西瑞香素含量为4.030 mg·g-1 ，与表2结果比较可见本提取工艺合理。
       3  讨论
          
       西瑞香素甲醇溶液于200 ～ 400 nm紫外区内进行扫描，于345 nm处有最大吸收，所以本实验采用345 nm为最大吸收波长。
       根据预实验结果，了哥王药材浸泡过夜提取的更完全。经正交设计实验直观和方差分析发现影响了哥王中西瑞香素提取的因素依次为乙醇体积分数>提取次数>提取时间，最佳提取条件为A2B2C3，即：75%乙醇溶液提取4次，2 h/次。按此最佳工艺条件进行验证实验，结果表明该工艺具有重复性，说明该提取工艺稳定，可为生产提供实验参考。
       【参考文献】
         　　［1］陈 扬，孙立新. 中药了哥王研究进展［J］. 沈阳药科大学学报，2009，26（7）：587.
       
       ［2］熊友香，王显武，尤志勉，等. HPLC测定不同产地了哥王药材中西瑞香素含量［J］.中成药，2009，31（8）：附18.
       
       ［3］Chen HC, Chou CK, Kuo YH, et al. Identification of a Protein Kinase C (PKC) Activator, Daphnoretin, That Suppresses Hepatitis B Virus Gene Expression in Human Hepatoma Cells［J］.Biochemical Pharmacology, 1996,52:1025.
       
       ［4］杨振宇，郭 薇，吴东媛，等. 了哥王中西瑞香素的提取分离及抗肿瘤作用研究［J］.天然产物研究与开发，2008，20（3）：522.
       
       ［5］杜智敏，杨振宇，郭 薇. 西瑞香素的提取方法及含西瑞香素的药物［P］.中国专利：CN101016286，2007-08-15.
       
       ［6］李艳敏，姜建国，曾治平. 了哥王中西瑞香素含量的HPLC法测定［J］.现代食品科技，2009，25（5）：563.