文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的研究麻疯树叶提取物对人恶性黑色素瘤A375细胞增殖和凋亡的影响。方法用MTT法测定不同浓度麻疯树叶提取物对体外培养的人恶性黑色素瘤A375细胞增殖的抑制作用，采用倒置显微镜观察细胞形态学的改变，并用Annexin-V-FIFT/PI双染色法检测细胞的凋亡。结果麻疯树叶提取物能抑制A375细胞增殖，诱导其凋亡，引起细胞形态学的改变，这些影响呈药物浓度剂量依赖性，并与药物作用时间正相关。结论麻疯树叶提取物在体外对人恶性黑色素瘤A375细胞的增殖具有显著的抑制作用，并能诱导其发生凋亡。
       【关键词】  麻疯树； 黑色素瘤A375细胞； 细胞增殖； 细胞凋亡
       Study on the Effects of Extract from Leaves of Jatropha curcas L．on the Proliferation Inhibition and Apoptosis Induction in Human Melanoma Cell Line A375
       LI Xing， TANG Lin，LEI Lei，LIU Juan， CHEN Fang
        
       （College of Life Science ，Sichuan University， Chengdu 610064，China）
       Abstract：ObjectiveTo investigate the anticancer effects of extract from leaves of Jatropha curcas L．on the inhibition of cell proliferation and apoptosis induction in human melanoma cell line A375 in vitro. MethodsThe A375 cells was cultured with different concentration of extract from leaves of Jatropha curcas L. The cell proliferation inhibition of A375 cells were measured by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) colorimetric assay. The morphological changes of A375 cells were observed by the light microscope. The cell apoptosis ratio was assessed by Flow Cytometry with the Annexin-V-FIFT/PI affinity assay.
       ResultsExtract from Leaves of Jatropha curcas L．significantly inhibited the proliferation of A375 cells and it induced cell apoptosis and morphological changes in dose-and time-dependent manners. ConclusionExtract from leaves of Jatropha curcas L．can inhibit the cell proliferation and induce cell apoptosis of malignant melanoma cells.
       Key words：Jatropha curcas L.; A375 cells;   Malignant melanoma cells;   Cell proliferation;   Cell apoptosis 
         
       麻疯树为大戟科(Euphorbiaceae)麻疯树属（Jatropha）植物，在亚洲、非洲和美洲的热带和亚热带地区广泛分布。其果仁富含油脂，可用于生产生物柴油，是近年来非常热门的生物能源作物，目前在我国川西干热河谷及贵州、云南、广东、广西、福建大量种植［1］。同时麻疯树还是一种很有价值的药用植物，据《中华本草》记载，其叶和树皮可治跌打瘀肿，骨折疼痛， 关节挫伤， 创伤出血， 麻疯， 疥癣， 湿疹， 癞头疮， 下肢溃疡，脚癣，阴道滴虫［2］。已有国内外研究报道其杀虫［3］、杀螺［4］、抗菌［5］、抗病毒［6］、抗HIV［7］等活性，同时国外在对与麻疯树同属的棉叶麻疯树、大根麻疯树的研究中已发现具有抗肿瘤活性［8～10］，但目前对麻疯树抗癌活性的研究报道很少。在前期进行的预实验中发现，麻疯树叶提取物对体外培养的卵巢癌细胞SKOV3、人肝癌细胞HepG2、Hela细胞、肺腺癌细胞株A549、胃腺癌细胞SGC-7901在光镜下观测未表现出抑制作用，而对黑色素瘤细胞A375表现出一定的抑制作用。为探讨麻疯树叶提取物是否具有抗恶性黑色素瘤的作用，本研究通过体外培养的黑色素瘤A375细胞为研究对象，观察麻疯树叶提取物对黑色素瘤A375细胞的增殖和凋亡的影响，旨在为进一步深入研究麻疯树的抗肿瘤机制提供实验依据。
       1  材料与仪器
       1.1  药物麻疯树叶采自四川省西昌市麻疯树种植基地，阴干，取1 kg干燥的麻疯树叶粉碎，于60%乙醇中室温浸泡3 d，过滤，滤液加活性碳脱色，过滤除去活性碳，将滤液减压浓缩至饱和，并冻干成粉末备用，提取物得率约9.8%。临用前用无血清的培养基配成实验所需浓度的工作液，无菌过滤备用。
       1.2  肿瘤细胞株  
       恶性黑色素瘤A375细胞株（由四川大学华西医学院免疫学实验室提供）。
       1.3  试剂及仪器乙醇，分析纯 （科龙化学试剂）；新生小牛血清（兰州明海）；RPMI－1640培养液（美国GIBCO）；四甲基偶氮唑盐（MTT，Serva公司）；AnnexinⅤ-FITC凋亡检测试剂盒（南京凯基生物科技）。RE252AA型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；7934001型冻干机（美国Labconco ）；STC 2500E二氧化碳孵箱（无锡科达）；酶联免疫检测仪（华东电子管厂）；倒置显微镜（日本OLYMPUS）；Coulter-X流式细胞仪（美国贝克曼公司）。
       2  方法
       2.1  细胞培养
       黑色素瘤细胞株A375培养于RPMI-1640培养液(含体积分数为10%新生小牛血清)，置37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中连续传代培养。
       2.2   MTT实验参考文献［11］报道，取处于对数生长期的黑色素瘤A375细胞株，用含0.02％EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，再用含10％新生小牛血清的RPMI－1640培养液吹打培养瓶底部，制成单细胞悬液。用RPMI－1640培养液调整细胞浓度为2×108/L，每孔接种细胞悬液50 μl于96孔培养板中，加入含不同浓度麻疯树叶提取物的RPMI－1640培养液50 μl，使麻疯树提取物终浓度分别为3， 6， 12.5， 25， 50， 100 mg/L。对照组则加入50 μl的RPMI－1640培养液。在37℃，5％CO2条件下培养24，48，72 h后，每孔中加入5 g/L MTT溶液20 μl，再孵育4 h，弃去上清液，再于每孔加入150 μl DMSO(二甲基亚砜)充分振荡至结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪上选择570  nm波长，用空白孔调零，测定各孔光密度（OD值）。每组重复3复孔，实验重复3次。按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率。
       
       肿瘤细胞生长抑制率（%） =(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100%
       2.3  流式细胞仪检测麻疯树叶提取物对A375细胞凋亡的作用细胞以3×105个/孔接种于6孔培养板中，24 h后加入麻疯树叶提取物工作液，使其最终浓度分别为25，50，100 mg/L，阴性对照组用等体积的RPMI－1640培养液替代。分别孵育24，72 h后，每孔收集1×105个细胞。预冷的PBS洗涤细胞2次，用500 μl结合缓冲液重悬细胞，加入Annexin-V-FITC和PI各5μl，混匀于室温避光孵育15 min。每组重复3复孔。在流式细胞仪上测定，数据由计算机处理并打印［12］。
       
       2.4  形态学观察倒置显微镜观察不同浓度麻疯树叶提取物作用黑色素瘤A375细胞72 h后，与阴性对照组比较，各药物浓度对黑色素瘤A375细胞形态的影响。
       2.5  统计学处理本实验数据采用SPSS15.0进行数据处理， 数据以±s表示，两组间的均数比较采取t检验。
       3  结果
       3.1  麻疯树叶提取物对A375细胞增殖的抑制作用不同浓度的麻疯树叶提取物作用A375细胞24～72 h后，对肿瘤细胞A375细胞增殖的抑制结果见表1。经统计分析结果显示，浓度为 3 mg/L麻疯树叶提取物处理组和阴性对照组之间在72 h内无明显差异(P>0.05)；但浓度为12.5～100 mg/L麻疯树叶提取物处理组能有效抑制A375细胞的增殖，并且随着麻疯树叶提取物浓度的增加及作用时间的延长，对细胞增殖的抑制率增加(见图1)，显示提取物对A375细胞增殖的抑制作用呈浓度和时间依赖性。表1  麻疯树叶提取物对A375细胞增殖的抑制作用（略）
       3.2   流式细胞仪检测结果麻疯树叶提取物作用于A375细胞结果，如表2所示，与阴性对照组比较，随着药物浓度增加，细胞凋亡率逐步升高，最高可达到36.64%，药物作用72 h细胞凋亡率明显高于作用24 h细胞凋亡率。图2为麻疯树叶提取物作用于黑色素瘤A375细胞72 h后，流式细胞仪检测其诱导黑色素瘤A375细胞凋亡相应图谱，Q2和Q4分别代表晚期和早期凋亡细胞。可见，麻疯树提取物能够诱导A375细胞凋亡，呈剂量依赖性，并且与药物作用时间呈正相关。表2  麻疯树叶提取物对A375细胞凋亡的影响（略）
       3.3   麻疯树叶提取物作用前后A375细胞形态学改变不同浓度麻疯树叶提取物作用A375细胞72 h后，倒置光学显微镜观察可见，阴性对照组A375细胞生长布满培养板底部，细胞排列紧密胞核、胞仁较大。而麻疯树叶提取物处理组与阴性对照组相比，细胞数量减少，部分细胞体积变小，变圆并浮起。随着药物浓度增加，细胞数量明显变少，更多细胞变成圆形，细胞表面突起多个小球状凋亡小体（图3）。
       4  讨论
          
       恶性肿瘤是一种严重威胁着人类生命与健康的疾病。由癌症造成的死亡人数居各种死亡原因之首，已成为人类重要的死亡原因之一。化学药物治疗，目前仍是治疗恶性肿瘤重要的手段之一。但是化学药物治疗目前普遍存在选择性差、毒副作用大、易产生耐药性等问题，不断寻找选择性高、毒副作用小的抗癌药是抗肿瘤新药研究的重点［13］ 。恶性黑色素瘤是一种恶性程度很高的皮肤癌，多发、易转移，故患者的年生存率极低，目前治疗黑色素瘤仍没有疗效好的化疗药物，化疗效果很差，有效率低于25%［14］ 。
       麻疯树虽然在我国并非传统抗癌中药，但作为一种具有很强生理活性［3～7］、毒理作用［15］的药用植物，特别是在同属植物中已有抗癌活性物质的发现，预示着麻疯树抗癌药物开发潜力巨大。在本实验室前期的研究中，已发现麻疯树种子中的麻疯树毒蛋白（curcin）体外具有抗肿瘤活性［16］，但由于麻疯树毒蛋白对人体属于异源蛋白，排异反应较大，虽然是未来生物治疗理想的免疫毒素，但不适合开发成为天然抗癌药物。因此有必要对麻疯树进行更多、更全面的抗癌活性筛选。
       
       根据美国癌症研究中心（NCI）用于筛选植物或动物粗提取物抗肿瘤活性的改进方案［17］，1985年之后以NCI为首的一些研究单位普遍开始采用针对肿瘤类型的筛选方法来代替针对化合物的筛选方法，即放弃体内小鼠筛选，代之为体外代表各种常见实体瘤的人类肿瘤细胞株进行初次筛选。目前在抗肿瘤天然药物筛选中最常用的MTT法具有快速、灵敏、简便，不需要特殊检测仪器等优点， 因此美国食品药品监督管理局(FDA)以及国内外一些权威的新药研发机构均采用MTT比色法作为抗肿瘤药物体外筛选的经典方法［18］。
       
       本研究通过MTT比色法观察发现，麻疯树叶提取物在一定范围内（12.5～100 mg/L）能显著抑制人恶性黑色素瘤A375细胞的增殖，并且其抑制作用表现出浓度和时间依赖性。光镜检测也同样观察到了经麻疯树叶提取物处理后的癌细胞细胞数减少、细胞变圆、外形皱折、凋亡小体等现象的出现。AnnexinV-FITC/PI双染色流式细胞分析法是灵敏、特异的定量检测细胞凋亡的方法，流式细胞仪分析结果表明麻疯树提取物能够诱导黑色素瘤A375细胞凋亡，呈剂量依赖性，并且与药物作用时间呈正相关。但也发现麻疯树叶提取物诱导A375细胞凋亡的活性并不平行于它的抗肿瘤作用强度（表1～2），这提示麻疯树叶提取物诱导的黑色素瘤细胞凋亡虽然是影响黑色素瘤细胞发生、发展、死亡的重要方式，但并不是唯一途径。
       
       综上所述，本研究首次报道了麻疯树叶提取物具有抑制人恶性黑色素瘤A375细胞的增殖和诱导其凋亡的作用，为今后进一步研究开发抗恶性黑色素瘤的新的治疗药物打下了实验基础。但麻疯树叶提取物抗恶性黑色素瘤的具体作用机制还有待于进一步深入研究。
       【参考文献】
         　　［1］林 娟，周选围，唐克轩，等.麻疯树植物资源研究概况［J］.热带亚热带植物学报，2004，12(3):285.
       
       ［2］国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草［M］.上海:上海科学技术出版社，2000:825.
       
       ［3］李 静，颜 钫，吴芬宏，等.麻疯树种子提取物对萝卜蚜的杀虫活性［J］.植物保护学报，2004，31(3):289.
       
       ［4］程忠跃，黄四喜，曾庆海，等.不同产地麻疯树素室内浸杀灭螺效果比较［J］.中国血吸虫病防治杂志，2001，13(4):221.
       
       ［5］魏 琴，廖 毅，周黎军，等.麻疯树毒蛋白(curcin)的抗真菌活性研究［J］.中国油料作物学报，2004，26(3):71.
       
       ［6］刘 娟，雷 蕾，颜 钫，等.麻疯树提取物体外抗病毒和杀菌作用的初步研究［J］.时珍国医国药，2009，20（8）：1890.
       
       ［7］Matsuse I T， Lim Y A， Hattofi M， et a1．A search for anti-viral properties in Panamanian medicinal plants: The effects on HIV and its essential enzymes［J］.J Ethnopharmacol，1999，64(1)：15．
       
       ［8］Kupchan SM， Sigel CW， Matz MJ， et al. Jatrophone， a novel macrocyclic diterpenoid tumor inhibitor from J. gossypiifolia［J］.J Chem Soc， 1970，92(14):4476.
       
       ［9］RM. Wiedhopf， E.R. Trumbull， J.R. Cole. Antitumor agents from J. macrorhiza I: Isolation and characterization of Jatropham［J］.Pharm Sci.， 1973，62(7):1206.
       
       ［10］Taylor M D， Smith Ⅲ A B， Furst G T， et al. New antileukemic Jatrophone derivatives from Jatropha gossypifolia: Structural and stereochemical assignment through nuclear magnetic resonance spectroscopy［J］.J Am Chem Soc，1983，105: 3177.
       
       ［11］Shim HY， Park JH， Paik HD， et al. Acacetin-induced apoptosis of human breast cancer MCF-7 cells involves caspase cascade， mitochondria-mediated death signaling and SAPK/JNK1/2-c-Jun activation［J］.Mol Cells，2007，24 (1):95.
       
       ［12］Loureiro J， Rodriguez E， Dolezel J， et al. Flow cytometric and microscopic analysis of the effect of tannic acid on plant nuclei and estimation of DNA content［J］.Ann Bot(Lond)，2006，98(3):515.
       
       ［13］孙 燕.肿瘤药物治疗百年回顾与展望［J］.中华肿瘤杂志，2004，26（11）：701.
       
       ［14］Clark WH， Elder DE， Guerry DT， et al. A study of tumor progression: the precursor lesions of superficial spreading and nodular melanoma［J］.Hum Pathol，1984，15(12):1147.
       
       ［15］贝新法，江凤鸣.有毒中草药的鉴别与中毒救治［M］.北京:中国中医药出版社，1993：68.
       
       ［16］Juan L， Fang Y， Lin T， et al. Antitumor effects of curcin from
       seeds of Jatropha curcas［J］.Acta Pharmacol Sin，2003，24(3):241.
       
       ［17］梁世乐，元英进.抗癌药物的筛选及其作用机制的初步研究［J］.天津大学学报，2000，10（3）：232.
       
       ［18］景永奎.抗肿瘤药物筛选方法的进展［J］.国外医学药学分册，1999，18（1）：1.