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马兰对动物离体子宫的兴奋作用及促凝血的实验研究
作者:唐祖年,杨月,杨成芳    
作者单位:桂林医学院,广西 桂林 541004

《时珍国医国药》 2010年 第9期

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       【摘要】 
       目的探讨马兰乙醇提取物对己烯雌酚预处理后大鼠、小鼠离体子宫的兴奋作用和对家兔体外凝血功能的影响。方法常规方法制备动物离体子宫标本,采用BL-420生物机能实验系统记录离体子宫平滑肌的活动, 以子宫收缩的幅度、频率及收缩力作为指标, 观察马兰乙醇提取物对注射己烯雌酚后大鼠、小鼠离体子宫兴奋作用,计算兴奋子宫的IC50,以益母草为阳性对照。促凝血采用家兔体外复钙和对凝血酶原(PT)的影响。结果马兰95%乙醇提取物和50%乙醇提取物对大鼠和小鼠离体子宫平滑肌有明显地兴奋作用,可加快收缩频率、提高收缩张力和子宫活力(P<0.05,P<0.01),并呈量效关系。马兰50%乙醇提取物能明显缩短复钙凝血时间(P<0.01),对凝血酶原时间无明显影响。结论马兰95%乙醇和50%乙醇提取物对大鼠和小鼠离体子宫平滑肌具有兴奋作用,其兴奋子宫平滑肌的作用强度较益母草稍强。并具有促凝血作用。
       【关键词】  马兰; 离体子宫; 兴奋作用; 凝血时间; 凝血酶原
       马兰Kalimeris indica (L.)Sch-Bip为菊科马兰属植物,全草可入药。据《本草纲目》记载:马兰可“破宿血、养新血, 止鼻吐血、合金疮、断血痢、解酒疸、诸菌毒、蛊毒”及治“腹中急痛, 痔疮”等病症。马兰又称鱼鳅串、鸡儿肠、路边菊、田边菊等,分布于我国的江苏、浙江、江西、福建、湖南 、湖北 、广东、广西、四川、贵州等地[1]。马兰味苦、辛,性温、寒,以全草或根入药,有清热解毒,散瘀止血,温肺止咳,散寒止痛,消积之功效,主治感冒发热,咳嗽,急性咽炎,扁桃体炎,流行性腮腺炎,传染性肝炎,胃、十二指肠溃疡,小儿疳积,肠炎、痢疾、吐血、崩漏、月经不调、外用治疮疡肿毒、乳腺炎、外伤出血、肺寒喘咳、胃脘冷痛等[2]。广西少数民族有用马兰治疗功能性子宫出血,崩漏等妇女出血性疾病之经验,并获得良好的疗效。据报道全叶马兰乙醇提取物,对蛋清所致大鼠足趾肿胀及二甲苯所致小鼠耳廓肿胀有抑制作用,对大鼠钾离子皮下透入致痛法与小鼠扭体法有抑制作用,显示出良好的抗炎镇痛作用[3]。药效学还研究表明马兰具有良好的镇咳和中枢抑制作用[4]。而马兰兴奋子宫和对凝血功能的实验研究未见报道。本文采用BL420生物机能实验系统,观察马兰乙醇提取物对注射己烯雌酚后的大鼠、小鼠离体子宫的影响及对凝血功能的影响。现报道如下。
       1  材料与仪器
       1.1  药品与试剂 
       马兰采自桂林地区(经桂林医学院药学系生药教研室王育生副教授鉴定),晒干备用。益母草购自桂林市药材市场。取马兰1 000 g,用中药材粉碎机粉碎后置于5 000 ml圆底烧瓶中加95%乙醇浸没,加热冷凝回流1 h,抽滤,重复上述操作3次;另取马兰800 g 加50%酒精浸没,加热冷凝回流1 h,抽滤,重复3次。分别用旋转蒸发仪将两种组分浓缩,45℃烘干后置冰箱备用。益母草提取方法与马兰相同。
       
       己烯雌酚注射液,天津金耀氨基酸有限公司,批号200801241;凝血酶原(PT)时间试剂盒,上海太阳生物技术有限公司,批号105035;云南白药,批号20081113,云南白药集团股份有限公司。
       1.2  动物Wistar大鼠,雌性,未孕,体质量(220±20)g;昆明种小鼠,体质量(30±2)g;家兔,体质量(2.2±0.2)kg;均由桂林医学院实验动物中心提供,许可证号:SCXK(桂)2007-0001。
       1.3  仪器SYC-15超级恒温水浴,北京桑力电子设备厂产品;旋转蒸发器(RE-52AA),郑州长城科工贸有限公司产品;BL420生物机能实验系统,成都泰盟科技有限公司产品。
       2  方法
       
 
       2.1  大鼠和小鼠离体子宫平滑肌张力的测定取正常未孕大鼠12只、小鼠12只,实验前24 h腹腔注射己烯雌酚,剂量分别为大鼠1 mg·kg–1,小鼠2 mg·kg–1,人工造成动物动情前期或动情期,以提高子宫敏感性。实验时大鼠、小鼠脱颈椎处死,迅速剖腹取出子宫,分离子宫壁上附着的结缔组织和脂肪组织,立即置于盛有营养液的玻璃皿中。将上述动物离体子宫标本阴道端系在盛有20 ml营养液(大鼠用DeJaion氏液[5]、小鼠用Tyrode[5]氏液)的麦氏浴槽L型通气管上,另一端与张力换能器(大鼠用0~5 g张力换能器、小鼠0~3 g用张力换能器)相连,通入氧气,每秒1个小气泡,麦氏浴槽控温在(36±0.5)℃。将BL-420生物信号采集系统,定标,调零,时间常数T=DC,G=20 mv,滤波调节F=20 Hz(小鼠F=50 Hz),扫描速度S=12.50 s/div[5]。实验前负荷(小鼠0.5 g、大鼠1 g),待稳定15 min后,开始实验。加入马兰或益母草95%乙醇组分和50%乙醇组分溶液,由低浓度到高浓度。给药后记录10 min离体子宫的收缩活动,每加入一个浓度药物待子宫平滑肌收缩达高峰后,更换营养液,冲洗3次,待离体子宫平滑肌稳定后,再加下一个药物浓度。直到测出该段子宫平滑肌收缩的最大效应(此时增加剂量不再增加收缩高度)。用Windows2007, Microsoft Excel数据分析工具,计算IC50,并计算子宫收缩强度、频率和子宫收缩活力。数据用t检验进行统计学处理。
       2.2  体外凝血实验取家兔6只,心脏取血,加入3.8%枸橼酸钠抗凝管(抗凝剂与血按1∶9)中, 轻轻混匀,制备抗凝血液。抗凝血浆的制备:抗凝血液经3 000 r/min,离心10 min,取上清液备用。
       
       将马兰50%乙醇提取物、云南白药粉剂溶于生理盐水,配制成1%浓度,进行凝血时间(全血复钙时间,血浆凝血酶原时间)的测定[6]。以云南白药为阳性对照,生理盐水为空白对照。全血复钙试验:取抗凝兔血0.7 ml加生理盐水或马兰或云南白药药液0.1 ml于试管内,置37℃水浴中孵育5 min,加入1/40 mol氯化钙0.1 ml,每隔30s轻轻倾斜试管1次,观察有无凝血,从加入氯化钙溶液开始记时,到倾斜试管血块凝固于管底而不流动时为止,即为凝血时间[7,8]。凝血酶原测定:按凝血酶原试剂盒说明操作,血浆0.1 ml,加PT试剂0.1 ml,对照组加30 μl生理盐水,给药组加药液30 μl,在有机玻璃板的凹坑内37℃孵育3 min,用大头针混匀,每隔3 s挑1次,直至出现凝块即为凝血酶原时间。每药重复试验3次,取其平均值,与生理盐水组比较求出凝血时缩短的程度。用t检验进行统计学处理。
       3  结果
       3.1  马兰95%乙醇和50%乙醇提取物对大鼠和小鼠离体子宫平滑肌兴奋的IC50测定结果 
       以马兰95%乙醇组分和50%乙醇组分对每个动物离体子宫标本收缩最高振幅为100%,依次计算出不同浓度收缩子宫百分率,以振幅的百分数为y轴,以最终浓度(mg·ml-1)为x轴,代入回归方程y=ax+b,经计算机(Windows2007, Microsoft Excel数据分析工具)求出a和b,再求出平均50%的效应即IC50。见表1。结果可见马兰95%乙醇组分对大鼠离体子宫的兴奋作用比益母草稍强。表1  马兰和益母草兴奋大鼠和小鼠离体子宫平滑肌的IC50结果(略)
       3.2  马兰95%乙醇和50%乙醇提取物对大鼠和小鼠离体子宫平滑肌兴奋强度、频率与活力的影响按文献方法[5]测定马兰95%乙醇和50%乙醇组分对大鼠和小鼠子宫收缩强度和频率,并计算子宫活力(子宫活力=平均强度×频率,单位g×次数/10 min),结果见表2~3。表明马兰95%乙醇和50%乙醇提取物对大鼠和小鼠离体子宫平滑肌收缩强度均明显增强,子宫活力明显增加(P< 0.05或P<0.01),收缩频率大鼠与小鼠明显增加。表2  马兰乙醇提取物对大鼠离体子宫收缩强度、频率与活度的影响,表3  马兰乙醇提取物对小鼠离体子宫收缩强度、频率与活度的影响(略)
       3.3  对家兔体外凝血的影响体外凝血试验,按文献计算凝血时间(凝血酶原时间)缩短率,即凝血时间(凝血酶原时间)缩短率=对照组血凝时间给药组血凝时/对照组血凝时间×100%。以药物凝血时间比空白对照组缩短30%以上者认为有效[6]。结果见表4,表明马兰50%乙醇提取物能明显缩短凝血时间(P<0.01),而对凝血酶原时间无缩短作用。表4  马兰50%乙醇提取物对家兔体外凝血的影响(略)
       4  讨论
       
   
       马兰既是药物也是一种食品,南方有的地方用马兰作野菜食用的习惯。营养学研究表明,马兰含20种氨基酸,多种微量元素如锌、锰、镁、硒等。天然药化研究表明马兰含木栓酮、木栓醇、达玛二烯醇乙酸酯、月桂酸、β-谷甾醇、脱镁叶绿甲酯酸等[1]。民间用于治疗鼻炎、鼻出血、牙龈出血、皮下出血、黄疸、肝炎、痢疾、小便涩痛、痔疮、宫颈炎、前列腺炎等多种疾病。我们的研究表明马兰的乙醇提取物对动物子宫有明显的兴奋作用,增加子宫收缩强度和频率,提高子宫收缩活力。凝血试验研究表明,马兰可明显缩短凝血时间,可能是治疗功能性子宫出血、崩漏等出血性疾病的药理学基础。对马兰兴奋子宫平滑肌和促凝血的有效成分和作用机制值得深入研究。
       【参考文献】
           [1]林 材,曹佩雪,梁光义. 马兰化学成分的研究[J]. 中国药学杂志,2006,41(4):251.
       
       [2]康文艺,赵 超,穆淑珍,等.马兰挥发油成分的研究[J].中草药,2003,34(3):210.
       
       [3]徐庆荣,张保功,刘 娟,等.全叶马兰的抗炎镇痛作用研究[J].中国现代应用药学杂志,2002,19(3):199.
       
       [4]石乐鸣,吕世杰,张连凯,等.全叶马兰镇咳作用的实验研究[J].中药材,1990,13(11):36.
       
       [5]唐祖年,梁成钦,覃文科,等.棕叶花提取物对动物子宫的兴奋作用[J].时珍国医国药,2008,19(5):1139.
       
       [6]王秀琴,伍素华,苏踊跃,等. 一种促凝血草药有效部位的初步确定及其凝血试验的研究[J].第三军医大学学报,2004,26(20):1841.
       
       [7]都述虎,全继曙. 仙桃草主要化学成分体外促凝血作用[J].中草药,1996,27(7):416.
       
       [8]刘 俭,田 泽,刘振秀,等.止血散对凝血系统的影响[J].中国实验方剂学杂志,2001,7(4):31.

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