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       【摘要】 
       目的研究纤维素酶法提取长春花中长春碱、长春质碱和文多林的最佳工艺。方法采用HPLC法测定长春碱、长春质碱和文多林的含量，通过单因素实验考察酶解温度、pH、酶解时间、加酶量、浸提倍数对长春碱、长春质碱和文多林提取率的影响。结果实验得出纤维素酶解长春花的最佳工艺为：温度40℃，pH 1.5，时间12 h，浸提倍数20，加酶量2 mg/g长春花。结论酶解法较酸水浸提法更有利于长春碱、长春质碱、文多林的提取。
       【关键词】  长春花； 长春碱； 长春质碱； 文多林； 纤维素酶
       Vinblastine, Catharanthine and Vindoline from Catharanthus roseus by Enzymolysis
       HE Jichan, DONG Zhichao, WANG Jianrong, YAN Xiaoxia
       (Germplasm Research Institute of Tropical Crops Genetic Resources Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Key Laboratory of Tropical Crops Germplasm Utilization, Ministry of Agriculture P.R. of China, Danzhou 571737, China)
       Abstract:ObjectiveTo study the optimal enzymatic extraction of vinblastine, catharanthine and vindoline from Catharanthus roseus (Linnaeus) G. Don.MethodsHPLC method was used to determine the contents of vinblastine, catharanthine and vindoline from C. roseus.Five factors were studied during enzymatic extraction of cellulase.ResultsThe optimal enzymatic extraction of cellulase was determined as follows: enzyme 2 mg for 1 g material, Ph1.5, buffer to raw material ratio 20, temperature 40℃, and enzymolysis time 12 hours.ConclusionCompared with the traditional acidic water extraction, the enzymolysis method can increase the extraction yield of effective components from C. roseus.
       Key words:Catharanthus roseus;  Vinblastine;  Catharanthine;  Vindoline;  Enzymatic cellulose
       
       长春花Catharanthus roseus (Linnaeus) G. Don是夹竹桃科(Apocynaceae)长春花属（Catharanthus roseus G. Don）一种重要的药用植物。长春花中含有大量的生物碱，长春碱(Vinblastine)是其中最重要的一种。长春碱在临床上主要用于治疗何杰金氏病、恶性淋巴肉瘤、急性白血病和绒毛上皮癌等［1,2］。而长春质碱(Catharanthine)、文多林(Vindoline)是半合成另一癌症治疗一线药物长春瑞滨的原料［3］。目前工业上长春碱主要是从长春花植株提取获得，存在着提取产率低、耗时等问题，且长春碱在植物中的含量极低，约为十万分之几。因此，寻找新的高效、节能、环保的提取和分离长春花中生物碱的生产工艺变得极为重要。近年来，纤维素酶被广泛应用于天然产物中有效成分的提取，它可以提高产品的产率和节约能源等。这是因为纤维素酶具有分解纤维素、破坏细胞壁、增加植物细胞内容物的溶出量及软化纤维素的作用，能使细胞的有效成分充分释放出来，达到提高提取产率的目的［4］。
       
       笔者应用纤维素酶对长春花进行酶解，采用RP-HPLC法测定长春碱、长春质碱和文多林的含量［3］，通过单因素实验考察酶解的温度、pH、酶用量、酶解时间、浸提倍数对长春碱、长春质碱和文多林提取率的影响，优选最佳工艺条件，为酶解法应用于长春花工业生产提供一定的理论依据。
       1  仪器与材料
       1.1  仪器Waters 1525型高效液相色谱仪，2487型紫外检测器（美国，Waters）；电子天平BT2202S(日本岛津)；PB20型精密pH计(上海雷磁仪器厂)。
       1.2  试药纤维素酶(天津奥凯实业有限公司)；长春碱、长春质碱、文多林(纯度≥98%，均自制)；长春花采于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所南药种质圃；甲醇、乙腈为色谱纯，氨水、二乙胺、磷酸为分析纯，水为二次蒸馏水；所有试剂在使用前均经0.45 μm微孔滤膜过滤。
       2  方法
       2.1  色谱条件色谱柱为Hypersil BDS-C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)柱；流动相为380 ml水－二乙胺(986∶14，用磷酸调pH 7.2)与620 ml甲醇－乙腈(4∶1)混合；流速1.5 ml/min；柱温为25℃；检测波长260 nm；进样量10 μl。色谱图见图1。
       2.2  标准品溶液的制备精密称取适量长春碱、长春质碱、文多林对照品，用5 ml甲醇溶解并置于同一容量瓶中，摇匀，用甲醇定容。三者配置的浓度分别为0.5，0.5和1.0 mg/ml。保存于4℃冰箱备用。
       2.3  线性关系考察精密量取上述对照品溶液0.05，0.10，0.15，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00 ml，分别置于10 ml容量瓶中，摇匀，用甲醇定容。精密吸取各浓度溶液10 μl注入液相色谱，按“2.1”项下色谱条件测定相应的HPLC图谱的峰面积。以长春碱、长春质碱和文多林进样量X为横坐标，峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程分别为Y长春碱＝2.34×107X＋1.28×105(r＝0.999 7)，Y长春质碱＝2.45×107X＋3.98×105(r＝0.999 9)，Y文多林＝1.19×107X＋8.52×104(r＝0.999 9)，结果表明，长春碱在0.001 7～0.006 8 mg/ml线性良好，长春质碱在0.008 2～0.032 9 mg/ml线性良好，文多林在0.018 6～0.093 1 mg/ml线性良好。该方法精密度、稳定性、重复性良好，加样回收率符合要求。
       2.4  提取方法精密称取一定量的长春花粉末，在不同的浸提倍数、不同的pH、不同的温度和纤维素酶下酶解不同的时间后，过滤，滤液加氨水调pH值至8.0。用四氯化碳多次萃取，合并萃取液，挥干。残渣加甲醇溶解，定容。上样前经0.45 μm微孔滤膜过滤。
       3  结果与讨论
       3.1  酶解温度对提取产率的影响酶解条件：长春花粉末20 g，浸提倍数20，pH 1.5，纤维素酶2 mg/g(以长春花粉末重量为基数，下同)，酶解时间12 h，温度分别选取30，35，40，45，50℃。
       在酶解反应中，温度既能改变酶反应本身的速度，也能导致酶蛋白变性失活。在一定的范围内，温度升高，反应速度加快，但温度超过一定程度时，又促进了酶蛋白的变性反应，使催化能力降低。因此，所有的酶反应都有一个最适温度或温度范围。当温度升高，长春碱、长春质碱和文多林的提取产率增大；但达到40℃后继续升高温度，长春质碱和文多林的提取产率增速趋缓，而长春碱提取产率反而下降(见图2)。这是因为长春碱在50℃以上开始分解氧化。因为在3种长春花生物碱中以长春碱的经济价值最高，因此，纤维素酶解长春花的最适温度选定为40℃。
       3.2    酶解时间对提取产率的影响酶解条件：长春花粉末20 g，浸提倍数20，pH1.5，纤维素酶2 mg/g，温度40℃，酶解时间分别选取为6，8，10，12，14 h。
       
       在酶解初始pH值、酶解温度和酶量一定的条件下，随反应时间的延长，长春质碱和文多林的提取产率逐渐提高，12 h后达到最大值；长春碱的提取产率也随时间的延长提取产率逐步提高，但长春碱比长春质碱和文多林更难溶出，需经长时间的浸泡(见图3)。这是因为随着时间的延长，纤维素酶与植物细胞得到充分结合，酶活力得到充分利用，酶解反应进行得较完全。但当提取产率达到一定值后，酶解反应时间的延长并不能增大提取产率，反而会浪费能耗。因此，最佳的酶解时间为12 h。
       3.3  酶解pH对提取产率的影响酶解条件：长春花粉末20 g，浸提倍数20，纤维素酶2 mg/g，酶解温度40℃，酶解时间12 h，选取pH的范围为1.0，1.5，2.0，2.5，3.0。
       
       酶是两性化合物，分子中含有许多羧基和氨基基团，因此酶反应需在一定的pH值条件下进行，过酸或过碱既影响酶的稳定性，也直接影响酶的催化活性。试验结果表明，在其它条件一定的情况下，当pH值为1.5时，长春碱、长春质碱和文多林的提取产率最高(见图4)。
       3.4  酶用量对提取产率的影响酶解条件：长春花粉末20 g，浸提倍数20，pH 1.5，酶解时间12 h，酶解温度40℃，加纤维素酶的量为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mg/g。
       
       实验结果显示，在反应体系其它因素不变的情况下，长春花各碱的提取产率先随着酶用量的增加而增大，但继续增加酶用量，提取产率反而有下降的趋势(见图5)。原因在于，随着酶量的增加，纤维素酶与纤维素分子的接触机会增加，在一定时间内，致使长春碱、长春质碱、文多林更多的溶出；达到最大值后，随着加酶量的增加，底物被酶分子所饱和，纤维素被水解的速度趋于稳定，致使长春碱、长春质碱和文多林的提取产率也趋于稳定。因此，纤维素酶的最佳加入量为2 mg/g。
       3.5  浸提倍数对提取产率的影响酶解条件：长春花粉末20 g，pH 1.5，酶解时间12 h，酶解温度40℃，加纤维素酶的量为2 mg/g，浸提的倍数为8，12，16，20，24。
       
       随着浸提倍数的增加，反应体系中纤维素酶的浓度会被稀释，纤维素酶与植物细胞壁纤维接触的几率下降，抑制了纤维素酶的水解反应。如图6所示，最佳的浸提倍数为20。
       3.6  酶法提取与酸水浸提效果比较
       3.6.1  酶法提取精密称取长春花粉末20 g，加入20倍pH 1.5的酸水，30 min后加入纤维素酶2 mg/g，于40℃条件下酶解12 h；过滤，滤液加氨水调pH值至8.0。用四氯化碳多次萃取，合并萃取液，挥干。残渣加甲醇溶解，定容。上样前经0.45 μm微孔滤膜过滤。
       3.6.2  酸水浸提精密称取长春花粉末20 g，加入20倍pH1.0的酸水，30 min后置于40℃条件下浸提12 h；过滤，滤液加氨水调pH值至8.0。用四氯化碳多次萃取，合并萃取液，挥干。残渣加甲醇溶解，定容。上样前经0.45 μm微孔滤膜过滤。结果见表1。表1  两种提取工艺的长春碱、长春质碱和文多林的提取产率（略）
       4  结论
          
       通过单因素实验得出纤维素酶酶解长春花的最佳工艺为：浸提倍数为20，温度40℃，时间12 h，pH 1.5，加酶量2 mg/g。与酸水浸提法比较，长春碱、长春质碱和文多林的提取产率有了较大幅度的提高。而是否应该进行正交实验进一步优化提取条件有待进一步的验证。
       
       酶法提取中先加入pH 1.5的酸水30 min后，再加入纤维素酶，目的是通过长春花中的生物碱来中和酸水的pH值，使其达到纤维素酶酶解长春花的最适pH值范围3.5～4（纤维素酶的最适pH值为3.5～5.5），从而达到酸水和纤维素酶共同软化、分解纤维素、破坏细胞壁、增加细胞溶出量的目的。
         
       长春碱为目前应用最为广泛的抗肿瘤药物之一，主要是从天然植物中提取，但仅从长春花中提取长春碱远不能满足日益增长的市场需求。因此，应充分利用现代提取分离技术来提高长春碱的提取产率。而酶处理技术能较大幅度提高药物有效成分的提取产率，且酶处理技术是在传统的中药提取基础上进行的，对设备无特殊要求，应用常规的提取设备即可完成。因此酶法提取长春碱对长春碱的工业生产有一定的实用意义。
       【参考文献】
         　　［1］徐任生，陈仲良.中草药有效成分提取与分离［M］.上海：上海科学技术出版社，1983:280.
       
       ［2］季宇彬.中药有效成分药理与应用［M］. 哈尔滨：黑龙江科学技术出版社，1995:488.
       
       ［3］罗 猛，付玉刚，祖元刚，等.反相高效液相色谱法快速测定长春花中4种生物碱［J］.分析化学，2005，33(1)：87.
       
       ［4］韩 丽. 实用中药制剂新技术［M］.北京：化学工业出版社，2002:116.