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       【摘要】 
       目的用不同菌种发酵和用纤维素酶预处理溪黄草，初步探讨发酵对溪黄草抑菌效果影响的机制，为开发廉价的食品添加剂，抑菌药物和节约药材资源提供新的研究途径。方法对溪黄草进行发酵等处理后，检测其醇提物的抑菌作用。结果微生物发酵对溪黄草抑菌效果存在一定的影响，酵母发酵能明显提高抑菌效果，与用纤维素酶处理的效果相似。结论利用合适菌种发酵提高药材有效成分的利用率是可行的。
       【关键词】  发酵； 溪黄草； 抑菌效果
       溪黄草系唇形科香茶菜属植物Rabdosia serra (Maxim.)Hara，由于和中药大辞典上所收录的中药溪黄草的原植物线纹香茶菜Rabdosia striatus (Benth.) Kodo外形相似而常作溪黄草入药，而且是广东药材市场上中药溪黄草的主流品种之一，用于清热利湿、凉血散瘀，治疗急性黄疸性肝炎、急性胆囊炎等［1］。
       
       目前关于溪黄草抑菌效果方面的研究，主要考虑将溪黄草的提取物作为一种健康的食品添加剂。姚勇芳［2］研究了溪黄草中抑菌物质的最佳提取条件，并验证了溪黄草的乙醇提取物对大肠杆菌具有抑制作用，对霉菌抑制效果不明显；战宇等［3］研究了溪黄草提取物的抑菌效果；梁盛年等［4］测定了溪黄草乙醇提取物的体外抗菌活性；段志芳等［5］还证实溪黄草水提物对杨桃果实具有一定的保鲜作用。
       发酵法一直是中药炮制方法之一，随着科学技术的发展，发酵法应用范围更加广泛。这种方法借助微生物的作用，改变中药原有药性，提高疗效，降低毒副作用，扩大适应症［6，7］。本研究以枯草杆菌、乳酸菌和酵母菌为发酵菌种，研究发酵后的溪黄草醇提物对细菌和霉菌生长的抑制效果，为高效提取溪黄草抑菌有效成分，大规模生产高效、低毒、广谱而经济实用的食品防腐剂、抑菌药物以及对于循环利用和处理每年药厂大量废弃的药渣提供了新的途径和方法。
       1  材料
       溪黄草购自梅州市温记百草堂，经嘉应学院生命科学学院廖富林教授鉴定为Rabdosia serra (Maxim.)Hara。美乐多购自梅州市太平洋商场。干酵母粉, 广东丹宝利酵母有限公司 。 枯草杆菌、JY-LZ乳酸芽孢杆菌、大肠杆菌、白葡萄球菌、黑曲霉、青霉菌保藏于嘉应学院生命科学学院实验室。纤维素酶（绿色木酶），酶活力>15μ/mg，上海伯奥生物科技有限公司。
       2  方法
       2.1  工艺流程溪黄草→粉碎→称取5 g→加入水或培养基→高压灭菌(121℃，20 min)→按10%接种量接种发酵菌种→于培养箱中静止10 d→提取→测定抑菌活性。
       2.2  发酵
       2.2.1  种子培养基枯草杆菌种子培养基：蛋白胨1%；牛肉膏0.3%；氯化钠0.15%；pH 7.0；蒸馏水配制；121℃湿热灭菌20 min。
       
       乳酸芽孢杆菌培养基：酵母膏1.0％；蛋白胨1.0％ ；葡萄糖1％；磷酸氢二钾0.05%；硫酸镁0.1%；硫酸锰0.05%；pH7.0；121℃湿热灭菌20 min。
       酵母菌培养基：去皮马铃薯20%，葡萄糖2%，蒸馏水配制，121℃湿热灭菌30 min。
       2.2.2  发酵培养基枯草杆菌发酵培养基：蛋白胨1%；葡萄糖1%；牛肉膏0.3%；氯化钠0.5%；pH7.0；蒸馏水配制；121℃湿热灭菌20 min。
       
        乳酸芽孢杆菌培养基：酵母膏1.0％；蛋白胨1.0％ ；葡萄糖2.5％；磷酸氢二钾0.05%；硫酸镁0.1%；硫酸锰0.05%；pH7.0；121℃湿热灭菌20 min。
       
       美乐多乳酸菌培养基：雀巢脱脂奶粉2%；葡萄糖1%；蒸馏水配制；121℃湿热灭菌15 min。
       
       酵母菌培养基：去皮马铃薯20%，葡萄糖2%，蒸馏水配制，121℃湿热灭菌30 min。
       2.2.3  种子培养将活化后的斜面枯草杆菌、乳酸芽孢杆菌分别挑取两接种环于相应的液体培养基中，接种后分别置于37℃培养箱中培养24 h。
       2.2.4  发酵培养称取5 g粉碎的溪黄草于100 ml的三角瓶内，加入30 ml蒸馏水， 121℃灭菌20 min。每瓶加入种子菌液3 ml，于适宜的温度下静止培养。同时做4种对照，即有5组实验：Ⅰ：溪黄草+水+菌；Ⅱ：溪黄草+水；Ⅲ：溪黄草+培养基+菌； Ⅳ：溪黄草+培养基；Ⅴ：培养基+菌。
       
       发酵：将枯草杆菌系列，乳酸芽孢杆菌系列，美乐多乳酸菌系列置于(36±1)℃的恒温培养箱中静置10d，干酵母菌系列于(28±1)℃的恒温培养箱中静置10 d。
       2.2.5  发酵前后菌数量的检测平板计数法，3个重复。
       2.3  抑菌物质的提取称取5 g的溪黄草置于3角瓶中，加入30 ml 95%的乙醇，于70℃的恒温水浴锅中水浴2 h后，滤纸过滤，取滤液，将其于同温度的水浴锅中挥干浓缩至稠膏状，再加入95%的乙醇溶解并定容至10 ml。定容后放入冰箱中保藏备用。
       发酵后的4个系列4 800 r/min离心20 min，固形物按上法处理。
       纤维素酶处理及抑菌物质提取：分别称取纤维素酶0.010 8 g和0.031 0 g，加入含5g溪黄草和30ml蒸馏水的三角瓶中，加入后放入55℃的恒温水浴锅中，水浴2 h后取出，滤纸过滤，滤渣按上法处理。
       2.4  抑菌活性的检测指示菌种活化后用无菌生理盐水制成106～107 cfu/ml菌悬液。
       
       取0.2 ml菌悬液涂布于牛肉膏蛋白胨或PDA培养基上，静置10min。
       待测样品用无菌毛细吸管吸取管长的1/3后，滴于直径为5 mm的无菌滤纸片上，每个平板上贴3片，分别做两个平行。95%乙醇作对照。
       
       将贴了滤纸片的平板放入恒温培养箱中，静置30 min后倒置培养，大肠杆菌和白葡萄球菌培养24 h取出，黑曲霉和青霉培养48h后取出，用游标卡尺测量其抑菌圈直径。
       3  结果
       3.1  微生物发酵对溪黄草抑制细菌生长的影响从表1可知溪黄草对白葡萄球菌的抑制作用比对大肠杆菌的抑制作用明显。表1  发酵溪黄草的抑菌效果（略）
       
       经枯草杆菌发酵和未经枯草杆菌发酵的溪黄草醇提物对细菌都具有一定的抑制作用，其中经枯草杆菌发酵后溪黄草的抑菌效果反而降低。表2结果发现发酵过程中枯草杆菌的生长会受到溪黄草的抑制，另外用溪黄草提取物直接进行平板试验，对枯草杆菌的抑菌直径为5.50 mm，也证实溪黄草对枯草杆菌生长的抑制。但不添加其他营养（I）时枯草杆菌仍然生长，证明枯草杆菌能利用溪黄草成分。枯草杆菌发酵会降低溪黄草的抑菌效果，可能是由于枯草杆菌在发酵过程中分解利用了抑菌有效成分或使抑菌有效成分降解。表2  微生物发酵后的菌落数（略）
       从表1可以看出，酵母菌发酵后溪黄草的抑菌效果大大加强，但与乳酸菌不同，酵母菌本身不含抑菌物质，因此发酵后其抑菌物质仍来源于溪黄草。溪黄草对酵母菌生长的抑制作用也比对大肠杆菌和白葡萄球菌的抑制作用强（d＝6.29 mm），因此不论有没有添加培养基，酵母在含溪黄草中培养时基本不增长，但发酵前后可以检测出活酵母菌，说明了在发酵过程中，酵母菌能生长。根据上述结果，认为经酵母菌发酵后溪黄草的抑菌效果增强的主要原因是由于酵母菌存在使溪黄草提取物中抑菌有效成分增加。
       3.2  微生物发酵对溪黄草抑制霉菌生长的影响经枯草杆菌、乳酸菌和酵母菌发酵的溪黄草醇提物作用于黑曲霉和青霉菌都没有产生明显的抑菌圈，这和其他文献报道的溪黄草的醇提物对霉菌抑制效果不明显［2］相一致。
       经乳酸菌发酵（包括乳酸芽孢杆菌和美乐多乳酸菌）的溪黄草醇提物对照组Ⅲ和Ⅴ在平板培养后，霉菌的生长不铺过滤纸片，而其他在平板培养后有少量的霉菌在滤纸片上生长，说明乳酸菌醇提物对霉菌也有一定抑菌效果。
        
       利用酵母菌发酵的Ⅴ在培养后霉菌铺过了滤纸片生长，Ⅱ和Ⅳ培养后有少量的霉菌在滤纸片上生长，而Ⅰ和Ⅲ培养后霉菌的生长并不铺过滤纸片，这可能同样是酵母菌发酵过程使溪黄草提取物抑菌有效成分浓度更高，使其抑制作用更强。
       3.3  纤维素酶处理对溪黄草抑菌作用的影响实验发现溪黄草醇提前先经过纤维素酶处理，其抑制细菌作用较未经酶处理的溪黄草醇提物有较大增强（表3）。当纤维素酶用量增加，溪黄草的醇提物的抑菌作用也随之增强。表3  纤维素酶处理后溪黄草的抑菌效果（略）
       
       实验发现经纤维素酶处理的溪黄草的醇提物对于霉菌（包括黑曲酶和青霉菌）都无明显抑制作用，但是经纤维素酶处理后的溪黄草醇提物，霉菌不覆盖滤纸片生长，而溪黄草的原药醇提物则有少量的霉菌在滤纸片上生长。
       
       添加纤维素酶对溪黄草进行预处理后，纤维素酶起到了破壁作用使得溪黄草的抑菌有效成分能够更容易地溶于乙醇中，从而增强了抑菌效果,这与其他应用纤维素酶提取中药时的效果一致［8，9］。根据结果，进一步推断上述酵母发酵溪黄草使其抑菌作用大大增强是由于酵母起到了破壁作用，使抑菌成分含量增加，同时酵母不会破坏抑菌成分。
       
       纤维素酶是可以由真菌和细菌等微生物在特定的条件下产生，那么利用微生物直接处理中药就可以起到破壁的作用，在大生产中可以降低原料的成本和简化操作。
       4  结论
          
       实验结果证实溪黄草对于细菌的抑制效果比较明显，对霉菌有一定的抑制效果。实验结果显示枯草杆菌和乳酸菌不能提高溪黄草抑菌效果，反而会使其抑菌效果下降；酵母菌发酵溪黄草可使其抑菌作用得到明显提高，与用纤维素酶处理效果相似，证明利用合适菌种发酵提高药材有效成分的利用率是可行的。同时，通过试验证实中药材可以为某些菌的生长提供必要的物质，可用于开发利用药渣，充分利用药材资源。
       【参考文献】
         　　［1］孟艳辉，邓芹英，许 国.溪黄草的化学成分研究(Ⅱ)［J］．天然产物研究与开发，1999，12(3):27.
       
       ［2］姚勇芳，连晓蔚，朱美娟,等.溪黄草中抑菌物质的提取及抑菌效果的研究［J］.食品科技，2008，1：191.
       
       ［3］战 宇，宁正祥.溪黄草提取物抑菌效果研究［J］.食品工业科技,2003, 24 (10):61.
       
       ［4］梁盛年，段志芳，付 莉.溪黄草乙醇提取物的体外抗菌活性测定［J］.食品科技，2003，12:58.
       
       ［5］段志芳，陈珊珊.溪黄草水提物对杨桃果实的保鲜作用研究［J］.食品工业科技，2007，28（8）：219.
       
       ［6］陆欣媛，刘松梅，郑春英，等 ，中药发酵研究概况［J］.黑龙江医药，2006，19（6）：469.
       
       ［7］吴炳新，牛纪江，孙筱林，等，中药发酵制药技术［J］.山东中医杂志，2001，20（3）：179.
       
       ［8］马田田. 纤维素酶用于中药提取的初步研究［J］.中草药,1994，25(3) :123，139.
       
       ［9］田秀兰.纤维素酶在杭白菊总黄酮提取中的应用［J］.齐齐哈尔医学院学报，2005，26（5）:542.表1 发酵溪黄草的抑菌效果mm