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       【摘要】 
       目的研究中药委陵菜中抗糖尿病主要活性成分委陵菜黄酮的分离纯化工艺。方法通过不同大孔吸附树脂和聚酰胺的分离性能考察和各种分离参数优化，确立分离工艺。结果选用AB-8大孔吸附树脂、聚酰胺色谱对委陵菜乙醇提取物进行分离，得到委陵菜黄酮组分。结论该方法稳定可行，适用于中药委陵菜中抗糖尿病活性成分的分离。
       【关键词】  委陵菜； 委陵菜黄酮； 分离工艺
       Isolation Process of Anti-diabetes Constituents from Potentilla chinesis
       ZHAO Chuan, DUAN Hongquan
        
       （School of Pharmacological Sciences, Research Center of Basic Medical Science, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China）
       Abstract：ObjectiveTo study the technological parameters of isolation of anti-diabetes constituents, potentilla flavone from Potentilla chinesis.
       MethodsThe separation process was established through evaluation of separation performance and the optimal separation conditions of macroporous absorption resin and polyamide.ResultsAB-8 Macroporous Resin and polyamide were chosen for isolation and purification from Potentilla chinesis. ConclusionThe extraction process is stable and suitable for industry.
       
       Key words： Potentilla chinesis;   Potentilla flavone;   Isolation process
       
       中药委陵菜Potentilla chinesis Ser.又名白头翁、蛤蟆草、天青地白，属蔷薇科委陵菜属，为多年生草本，在《中国药典》2000～2005年版中均有记载，临床上多以其单方或复方治疗糖尿病。本实验室在前期委陵菜糖尿病有效成分的研究中，得到一个具有明显降血糖活性的单体化合物-委陵菜黄酮，进一步药理毒理考察表明其作为降血糖候选药物，具有良好的开发应用前景［1］，并确定了委陵菜黄酮的提取工艺，本文将考察委陵菜黄酮的分离工艺。
       1  仪器与试剂
          
       旋转蒸发器：SENCOR系列，上海申生科技有限公司产品；电子分析天平：FA2004N型，上海恒平科学仪器有限公司产品；KQ-100型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司产品；DZX-3型真空干燥箱，上海福玛实验设备有限公司产品；DLSB-5/20低温冷却液循环泵，上海豫康科教仪器设备有限公司产品；SSI Lab AllianceTM 高效液相色谱系统。
       
       甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯，购自天津基准化学试剂有限公司。
       
       D-101、AB-8大孔吸附树脂，精品级，20～60目，天津海光化工厂产品；聚酰胺80-100目，上海天莲精细化工有限公司产品。
       2  方法与结果
       2.1  静态吸附与解吸［2］
       2.1.1  静态吸附称取适量委陵菜提取物，以40%乙醇溶液溶解，定容至50 ml，加入已处理好的柱填料（AB-8、D101树脂，聚酰胺）5 g（湿重），每隔30 min振荡30 s，持续2 h，静置24 h，过滤，滤液以甲醇定容至100 ml，以HPLC法测定委陵菜黄酮含量，然后浓缩至干，干燥，称重。计算委陵菜黄酮及提取物吸附量。
       2.1.2  解吸将静态饱和吸附树脂加入95%乙醇50 ml，每隔30 min振荡30 s，持续2 h，滤出溶液，以95%乙醇淋洗两次，滤液定容至100 ml，测定委陵菜黄酮的含量，然后浓缩至干，真空干燥，称重。计算提取物解吸率和委陵菜黄酮解吸率。结果见表1。表1  静态吸附与解吸（略）
       
       2.2  动态吸附与解吸［3］称取已处理好的柱填料50 g（湿重），湿法装柱，以40%乙醇配置适量提取物样品溶液150 ml上样，先以2倍量柱体积50%乙醇冲洗，再依次用70%，95%乙醇洗脱（流速1.5B V/h），分别测定各洗脱溶液中委陵菜黄酮的含量和精密称定洗脱提取物的质量，计算提取物和委陵菜黄酮的动态吸附量和洗脱率。结果见表2。表2  动态吸附与洗脱（略）
       从结果中可以发现，虽然聚酰胺对提取物的吸附量远高于其余两种树脂，但对提取物的洗脱率则很低。AB-8树脂与D101比较，D101黄酮洗脱率较高，但是黄酮吸附量和吸附样品中黄酮含量仅为AB-8的1/2，从分离纯化角度考虑，选择AB-8树脂较好。
       2.3  AB-8树脂柱洗脱条件考察［4］
       2.3.1  泄漏曲线及洗脱曲线取已经处理好的AB-8树脂50 g湿法装柱，以30%乙醇溶解适量提取物，离心，上样，流速2 BV/h，按倍量收集过柱液，测定委陵菜黄酮及提取物的浓度。结果见图1～2。
       
       根据委陵菜黄酮和提取物的泄漏曲线，选择上样量为10倍量柱体积。将泄漏曲线步骤中吸附饱和的树脂分别以5倍量40%，50%，60%乙醇洗脱，测定洗脱液中黄酮单体的浓度。结果见图3。
       2.3.2  吸附流速考察在“2.3.1”项下柱层析条件下，选择上样流速为1，2，3，4，5 BV/h进行实验，考察吸附量。由图4可见，随着吸附流速的提高，委陵菜黄酮的吸附量呈逐渐下降，而提取物的吸附量则在4 BV/h时达到最高。在委陵菜黄酮吸附量较高条件下，提取物吸附量较少，有利于委陵菜黄酮的纯化，故选择2 BV/h作为吸附流速。
       
       2.3.3  洗脱流速考察在“2.3.1”项下柱层析条件下，选择洗脱流速为1，2，3，4 BV/h进行实验，从图5可知，4种流速的洗脱均需要约5倍量柱体积才能洗脱完全。考虑到较高流速需要加压，因此选择与吸附流速同样的速度洗脱为宜。
       2.4  第2次分离实验以AB-8树脂柱分离药材提取物，洗脱组分中委陵菜黄酮的含量由0.3%提高了10～12倍（近4%），但仍需要进一步分离。
       2.4.1  AB-8树脂柱第2，3次分离考察取第1次AB-8树脂柱分离得到的委陵菜黄酮粗组分，按照上述条件依次进行2，3次分离，计算60%乙醇洗脱流分中委陵菜黄酮含量。结果见表3。表3  AB-8树脂第2，3次纯化分离（略）
       由表3可知，AB-8树脂柱第2次分离，委陵菜黄酮的含量提高了约2倍，而继续第3次分离时没有纯化效果，有必要选择其他的色谱填料进行纯化。
       2.4.2  聚酰胺纯化取第1次AB-8树脂柱分离得到的委陵菜黄酮粗组分，以聚酰胺色谱柱分离，按照“2.3”的柱色谱条件依次以30%，50%，60%，70%，80%，95%乙醇洗脱，每个梯度5BV，测定各洗脱流分中委陵菜黄酮的含量。结果见图6。
       由图6可知，聚酰胺色谱柱分离委陵菜黄酮粗组分，委陵菜黄酮含量明显大于AB-8树脂柱的两次分离流分，而30%～60%乙醇洗脱流分中黄酮的含量达到18.3%，提高了4.5倍以上，因此选择聚酰胺作为第2次分离的柱填料。
       3  小结
           
       根据上述考察结果，确定委陵菜黄酮分离工艺为：将委陵菜60%乙醇提取物，按照重量比10倍量30%乙醇溶解，离心，取上清液，以AB-8大孔吸附树脂柱分离，10 BV上样，吸附和洗脱流速为2 BV/h，依次以3 BV30%乙醇、5 BV60%乙醇、4 BV95%乙醇洗脱，收集60%乙醇洗脱液，减压浓缩至无醇味，得到的混悬液以等体积30%乙醇溶解，离心，上清液以聚酰胺柱分离，10 BV上样，依次以3 BV30%乙醇、5 BV60%乙醇、4 BV95%乙醇洗脱，收集60%乙醇洗脱流分，减压浓缩得到委陵菜黄酮粗品（3批次含量18%～19%）。
       【参考文献】
         　　［1］赵 川, 乔 卫, 张彦文,等.委陵菜抗糖尿病有效部位及有效成分的研究［J］.中国中药杂志,2008，33(6)：680.
       
       ［2］刘 臣，张君寿. 大孔吸附树脂分离纯化刺五加苷D的研究［J］.中成药，2004，26（9）：701.
       
       ［3］杨荣平，王宾豪，方艾权，等. 大孔树脂分离葛根总黄酮工艺优化［J］.中成药，2004，26（10）：784.
       
       ［4］安彩贤，李冶姗. 大孔吸附树脂分离纯化葛根与山楂叶中总黄酮的研究［J］.中成药，2004，26（9）：698.