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       【摘要】 
       目的研究西归多糖的提取工艺并测定多糖的含量。方法通过正交实验确定最佳提取工艺，苯酚-硫酸法测定西归总多糖含量。结果最佳提取工艺为提取次数3次，固液比1∶10，提取时间1 h，提取温度90℃。西归总多糖含量为32.71%。结论该提取工艺合理，测定方法准确。
       【关键词】  西归； 多糖； 苯酚-硫酸法
       西归是伞形科属植物西藏凹乳芹Vicatia thibetica de Boiss.的干燥根［1］，主要分布于云南西北部、四川西部及西藏等地。西归在云南大理有悠久的栽培历史，在大理等地常作为滋补蔬菜炖肉、炖鸡等食用，鲜品也可生吃, 风味独特［2］。西归含有较多的糖醇和糖［3］。多糖( polysaccharide) 是构成生命的四大基本物质之一，多糖在增强免疫力、降血糖、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗衰老、抗凝血等方面发挥着生物活性作用。因此对多糖的研究与开发已越来越引起人们的广泛关注［4］。有关西归中多糖的研究尚未见文献报道。本文对西归中多糖的提取工艺和含量进行了研究，为合理开发、综合利用西归资源提供了切实可行的工艺路线。
       1  仪器与材料
       1.1   仪器SY-21型电热恒温水浴箱（北京泰克仪器有限公司），TU-1800SPS紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司），FA1004-53423电子天平（上海天平仪器厂），离心机，真空冷冻干燥机等。
       1.2    药材与试剂  
       葡萄糖、乙醇、苯酚、硫酸、氯仿、正丁醇均为AR级。西归购自云南省大理州鹤庆县马厂乡，经本院生药教研室周浓老师鉴定为西藏凹乳芹Vicatia thibetica de Boiss.的干燥根。
       2  方法与结果
       2.1  多糖的提取及换算因子测定
       2.1.1  西归多糖的提取与精制 
       称取西归粗粉50 g，按比例加入蒸馏水，于恒温水浴锅中回流提取，布氏漏斗过滤，将滤液于旋转蒸发仪上进行浓缩，浓缩至约80 ml时，用Savage法除蛋白，即是向浓缩液中加入1 /5 V的氯仿和1 /25 V的正丁醇，强烈振摇30 min，以3 000 r/min离心15 min，除去交界处变性蛋白，水层仍按照此方法反复除蛋白，直至氯仿层与正丁醇层之间无白色沉淀。然后在上清液中加入一定量无水乙醇，使乙醇的终浓度达一定比例，静置过夜。沉淀用布氏漏斗抽滤，滤渣以无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤多次，沉淀放入真空冷冻干燥机内，冷冻干燥48 h，得灰白色粉末状的粗多糖。
       2.1.2  多糖换算因子测定取粗多糖20 mg，精密称定，分别加水溶解并定容至100 ml，精密量取1.0 ml，按标准曲线绘制方法操作，利用标准曲线计算单糖浓度， 按公式f=WC×D计算换算因子f ［W为多糖的重量(mg)，C为溶液中单糖的浓度(mg/ml )，D为稀释倍数］。测得西归多糖的f＝0.986 3（RSD=1.84%，n =6)。
       2.2  样品多糖的测定取干燥样品粉末1 g，精密称定，至圆底烧瓶中，精密加蒸馏水10 ml，90℃回流提取3次，1 h/次，滤过，滤液定容至100 ml，精密量取续滤液1.0 ml，按标准曲线绘制方法操作，测定其吸光度，按公式计算：多糖含量（%）=C×D×fW×1 000×100%［C为样品溶液的葡萄糖浓度(mg/ml)，D为样品溶液的稀释倍数，W为样品的重量(g)，f为换算因子］。
       2.3  苯酚试剂的制备取100 g苯酚，加入0.1 g铝片和0.05 g碳酸氢钠，在180～182℃蒸馏，空气冷凝，得白色针状苯酚结晶。称取5 g此结晶于100 ml量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，避光保存，即得浓度为5%的苯酚试剂。
       
       测定波长的选择：用一定浓度的葡萄糖标准溶液和供试品溶液各1.0 ml置具塞试管中，分别加入5%苯酚溶液1.0 ml摇匀，然后加入浓H2SO4 5.0 ml，摇匀，另以1.0 ml蒸馏水作为空白液同上操作，沸水浴中恒温15 min，取出，冰水浴冷却至室温，在波长200～800 nm之间扫描。结果供试品与标准品溶液在487 nm波长处均有最大吸收，故选用487 nm为检测波长。
       2.4  正交实验根据有关资料报道，提取次数(A)，固液比(B)，提取时间(C)，提取温度(D) 4个因素，每个因素3个水平，选用L9(34)正交实验方案提取西归多糖，以多糖含量为指标确定最佳提取工艺。因素水平见表1，正交实验结果见表2。表1  西归多糖提取实验因素水平，表2  L9 (34 )正交实验结果（略）。
       由正交实验数据可以得知，各因素对西归总黄酮含量的影响程度不同，其影响大小依次为：D(提取温度)>B（固液比）>A（提取次数）>C（提取时间）。其最佳提取条件为：A3B1C2D2，即提取次数3次，固液比1∶10，提取时间1 h，提取温度90℃时，提取效果最好。
       2.5  最佳提取工艺验证
       在上述最佳条件下进行3次重复实验。结果见表3。表3  最佳条件验证实验（略）
       
       从表3可看出，最佳提取工艺条件具有较好重复性，说明该最佳工艺条件是合理、可靠的。
       2.6    方法学考察
       2.6.1    标准曲线的绘制精密称取在105℃干燥至恒重的葡萄糖适量，配制成100.4 μg/ml的标准贮备液，精密量取1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00，7.00 ml置50 ml量瓶中，定容后作为葡萄糖标准溶液。在具塞试管中依次加入不同浓度的标准葡萄糖溶液1 ml，加苯酚溶液1.0 ml，摇匀后加浓硫酸5.0 ml，摇匀，沸水浴15 min，冰水浴冷却至室温后，用蒸馏水做空白参比，于487 nm波长处测定吸光度。以吸光度A为纵坐标，葡萄糖浓度C为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程：A=9.311C +0.000 4 ( r = 0.996 5)。结果表明葡萄糖溶液在20.1～120.3 μg/ml范围内线性关系良好。
       2.6.2  稳定性实验
       取同一份供试品溶液，按“2.6.1”项下方法分别显色，于0，10，30，60，90，120 min时测定吸光度。测定吸光度在120 min内RSD=0.43%，表明供试品溶液在120 min内吸光度稳定。
       2.6.3  精密度实验
       
       取同一份供试品溶液6份，按“2.6.1”项下方法分别显色，测定吸光度。显色的结果RSD=1.99%，表明方法的精密度符合测定要求。
       2.6.4  加样回收率实验
       精密称取已知多糖含量的样品6份，分别加入葡萄糖，按样品测定方法制备供试品溶液并测定吸光度值，计算加样回收率。本法加样回收率为97. 9%～105. 2%，平均回收率为101. 0%，RSD=2. 63%（n=6）。结果表明该方法的准确度较高。
       3  讨论
          
       提取条件实验采用正交实验方法，对西归多糖的提取条件进行了优化。由正交分析结果可知该多糖提取中，温度是主要影响因素，其次是固液比，提取次数和提取时间影响。因此在提取时应注意控制提取温度和固液比，该工艺条件简单，稳定可行，多糖稳定性好，可作为总多糖的提取工艺条件，为有效开发利用西归提供了理论参考。
       
       苯酚-硫酸法测定样品中多糖含量的原理是多糖在浓硫酸水合产生的高温下迅速水解，产生单糖，单糖在强酸条件下与苯酚反应生成橙黄色溶液，该溶液在特定波长处和一定浓度范围内，吸收度值与浓度呈线性关系［5］。本文利用苯酚——硫酸法测定了西归的主要活性成分——多糖，为西归进一步开发及其多糖生物学活性研究奠定基础。
       【参考文献】
         　　［1］中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志，第55卷，第一分册［M］.北京：科技出版社，1979：185.
       
       ［2］周 浓，段意梅，陈 强，等.白族药西归的生药学鉴定［J］.安徽农业科学，2007，35(8)：2307.
       
       ［3］张维明，段志红，孙 凤，等.西归的化学成分研究［J］.天然产物研究与开发，2004，16(3):218.
       
       ［4］姜曼花，邱细敏，刘胜姿，等.白背三七多糖的提取纯化及含量测定［J］.时珍国医国药，2008，19（9）：7412.
       
       ［5］韩燕全，黄正明，杨新波，等.苯酚-硫酸法测定不同工艺六味地黄口服液中多糖的含量［J］.解放军药学学报，2008，24（4）：349.