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       【摘要】 
       目的探讨养心通脉有效部位方（active principle region of Yangxing Tongmai Formula，apr-YTF）促进急性心肌梗塞大鼠骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）定向归巢及其对心功能和病理的影响。方法将造模成功的大鼠32只，随机分为apr-YTF组、香丹注射液组、重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）组、模型对照组，每组8只，均于造模3 h后给予相应药物，连续5 d；均于造模后第2天开始腹腔注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu），连续4 d。用PcLab生物医学信号采集处理系统检测记录心功能，masson"s三色染色检测梗塞心肌病理，Image-Pro Plus 6.0病理图象分析系统测量梗塞区瘢痕面积百分比，免疫组化的方法检测梗塞心肌边缘区的CD34+染色阳性细胞数、Brdu与肌钙蛋白I（cTn I）双染阳性细胞数。结果rhG-CSF组和apr-YTF组的心功能4个指标较模型组均有显著改善（P＜0.05或P＜0.01）；两组的心肌梗塞边缘区瘢痕组织内可见新生的心肌细胞和血管，恢复的趋势较为明显；两组的心室肌瘢痕面积百分比较模型组和香丹组显著减小（P＜0.01）；两组大鼠梗塞心肌边缘区CD34+染色阳性的细胞数、Brdu与cTn I双染阳性的细胞数较模型组显著增加（P＜0.01），apr-YTF组较rhG-CSF组显著增加（P＜0.01）。结论pr-YTF能促进MSCs归巢并因此而促进心肌细胞和心功能恢复。
       【关键词】  养心通脉有效部位方； 骨髓间充质干细胞； 归巢； 心功能； 病理
       Effect of Apr-YTF（Active Principle Region of Yangxing Tongmai Formula）on Cardiac Function and Pathology of MSCs Homing to Infarcted Myocardium in Rats
       LI Yonghua,ZHENG Jinghui, WANG Liping, JIAN Weixiong,HUANG Xianping, YUAN Zhaokai
        
       （Chongqing Three Gorges Medical College，Wanzhou  404020,China；Institute of TCM Diagnostic, Hunan University of Traditional Chinese Medicine，National Key Disciplines，Changsha  410007,China）
       Abstract：ObjectiveTo explore the effect of apr-YTF（active principle region of Yangxing Tongmai Formula） on cardiac function and pathology of MSCs homing to infarcted myocardium in rats.Methods32 SD male rats with acute myocardial infarction were randomly divided into apr-YTF group,Xiangdan injection group,recombinant human granulocyte colony stimulating factor (rhG-CSF) group and model control group 8 in each group. After 3 h, myocardial were given corresponding drug for 5 d. 5-bromo-deoxyuridine (Brdu) was intrapthtoneally injected on day 2 after model establishment for 4 days. Cardiac function with PcLab biomedical signal acquisition and processing system , myocardial infarction pathology was detected by masson"s three-color, Image-Pro Plus 6.0 image analysis system was used to determine infarct scar area percentage. Positive cells, Brdu and cardiac troponin I (cTn I) double staining positive cells were determined by immunohistochemistry.Results Four indicators of cardiac function in rhG-CSF group and apr-YTF group were significantly improved compared with the model group (P<0.05 or P<0.01); myocardial infarction scar tissue was seen in the marginal zone of the myocardial cells and vascular newborn.Percentage of ventricular muscle scar area was significantly reduced compared with model group. The two groups of rats with myocardial infarct marginal zone stained positive and Xiangdan injection group (P<0.01) CD34+ cells, Brdu and cTn I double staining positive cells increased significantly compared with model group (P<0.01). Apr-YTF group were significantly increased compared with rhG-CSF group (P<0.01).ConclusionApr-YTF can promote the homing of MSCs, and thus contribute to cardiac function recovery.
       Key words： Apr-YTF;  MSCs;  Homing;  Cardiac function;  Cardiac pathology
         
       养心通脉有效部位方（active principle region of Yangxing Tongmai Formula，apr-YTF）是由本课题组根据著名中医学家秦伯未先生运用“扶养心气，和通血脉”之法治疗胸痹心痛的有效名方研制而成的，研究表明，本方具有良好的抗急性心肌缺血、抗缺血再灌注损伤、改善血液流变学等作用［1，2］。通过骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）移植改善缺血心肌功能，重建梗塞组织丧失的心肌细胞以治疗缺血性心脏病，显示有良好的临床应用前景，已成为国内外心血管病研究领域的热点［3］。那么，apr-YTF能否促进MSCs归巢于急性缺血梗塞心肌组织并发挥促进梗塞心肌修复和保护心功能的作用，值得进一步研究。现将探讨实验报道如下。
       1  材料与仪器
       1.1  动物雄性SD大鼠，体质量220～260 g，由湖南中医药大学动物实验中心提供，动物许可证号：SCXK（湘）2009-0004。
       1.2  药物与试剂养心通脉有效部位方，由中南大学药学院依本课题组稳定的制作工艺制作提供；重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF），齐鲁制药有限公司；香丹注射液（复方丹参注射液），北京双鹤高科天然药物有限责任公司；5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu）、Brdu鼠源性多克隆抗体、CD34+兔源性多克隆抗体，鼠SP免疫组化染色试剂盒、兔SP免疫组化染色试剂盒、DAB免疫组化显色试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司；心肌肌钙蛋白I（cTn I）抗体、Polymer双染检测试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司。
       1.3  仪器PcLab生物医学信号采集处理系统，北京微信斯达科技发展有限责任公司；数字彩色显微图像分析系统7001×UVI，英国UVI；Image-Pro Plus图像分析系统，美国。
       2  方法
       2.1  造模参考文献［4，5］方法：取健康清洁级雄性SD大鼠60只，适应性饲养观察1周，以3%水合氯醛腹腔麻醉(10 ml/kg)，背位固定，颈部去毛，剪开皮肤，分离颈前肌，暴露气管，游离并用双线穿过，提起双线，先用20号穿刺针尖刺破3～4气管软骨间，再以20号穿刺针头(改为尖端圆钝)经破口插入气管，另端连于微型人工呼吸机行正压呼吸(呼吸时比1∶1，呼吸频率80次/min，潮气量10 ml/kg)，动脉夹将双线在气管穿破处固定，盖PBS湿纱布，胸部去毛，消毒，离正中线约0.5 cm处纵行切开皮肤约2cm，逐层分离肌肉，在第3～4肋间剪破肋间肌层，以自制小拉钩拉开胸腔，轻压右侧胸廓，暴露心脏，小心剪开心包膜，以3／8不锈钢小圆针和6/0号丝线穿过肺动脉圆锥与左心耳交界稍下1～2 mm处，结扎左冠状动脉前降支。结扎前后记录Ⅱ导联心电图，以结扎部位以下心肌变苍白、搏动减弱且出现J点明显抬高为造模成功，逐层缝合胸壁，待动物恢复自主呼吸后，停止人工呼吸，缝合气管和颈部皮肤。
       2.2  分组取造模成功的大鼠32只，随机分为4组，分别为apr-YTF组、香丹注射液组、rhG-CSF组、模型对照组，每组8只。
       2.3  给药方法apr-YTF组，按1.2g/（kg·d）剂量腹腔注射PBS稀释的apr-YTF注射液；香丹注射液组，按1.2 g/（kg·d）剂量腹腔注射PBS稀释的香丹注射液；rhG-CSF组，按10 μg/（kg·d）剂量皮下注射PBS稀释的rhG-CSF注射液；模型对照组，腹腔注射与apr-YTF组等量的PBS。均于造模3 h后给药，连续5 d。每只大鼠均于造模后第2天开始腹腔注射Brdu，用PBS配至浓度为5 mg/ml，按50 mg/（kg·d）给药，连续4 d。
       2.4  检测指标及方法
       
       2.4.1  大鼠的在体心功能测定用3%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，固定于鼠板上，右侧胸锁乳突肌附近找到颈动脉，行颈动脉插管；用压力定标器定标后，将三通管及微型导管与压力传感器及记录仪连接；PcLab生物医学信号采集处理系统先记录升主动脉压力曲线，稳定10 min，将导管进入左心室记录左室压力曲线， 并同步记录心率(HR)；应用PcLab生物医学信号采集处理系统测量心功能参数：左室收缩压（LVSP）、左室舒张末压（LVEDP）、左室内压上升及下降最大速率（±dp/dtmax），以反映左室收缩与舒张功能。
       2.4.2  心肌组织的形态变化检测每只心脏注入10%氯化钾2ml，使心脏停搏于舒张期，开胸取出心脏，自心尖向心底将左心室切成5等份，用10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，按3 μm厚连续切片，经masson"s三色染色。观测： 心肌组织的病理变化：用光镜观察病理变化。 大鼠心室肌瘢痕面积百分比平均值：采用Li RK［6］的方法进行左室瘢痕面积百分比的测定。采用图像分析定量分析每一切块的左室游离壁瘢痕面积。用Image-Pro Plus 6.0病理图象分析系统测量左室截面积和瘢痕面积，瘢痕长度为内膜瘢痕长度与外膜瘢痕长度的平均值。瘢痕面积是瘢痕长度乘以切块厚度（计算百分比时将切块厚度设定为X即可），总的瘢痕横面积是5个切块之和。左室截面积采用相同方法计算。瘢痕面积占左室截面积的百分比，即瘢痕面积(%)=瘢痕面积/左室截面积×100%。
       2.4.3  心肌组织中CD34+细胞的数量  在正中间切块的同部位沿心脏长轴切3 μm厚切片，按免疫组化试剂盒说明书的操作步骤进行CD34+细胞的抗原抗体免疫组织化学染色，以细胞内出现棕黄颗粒沉着为阳性反应。用数字彩色显微图像系统随机拍摄心肌梗塞边缘区10个高倍视野，以Image-Pro Plus 6.0图像分析系统精确计算CD34+细胞的数量，取其均值作为测定值。
       2.4.4  心肌组织中Brdu与cTn I双染阳性细胞同上步骤取切片，按双染试剂盒说明书的步骤，用抗Brdu抗体和cTn I抗体作免疫组织化学双染染色，以心肌中Brdu与cTn I的双染阳性细胞（胞核为红色，胞浆为黄色）为各组处于分化增殖状态心肌细胞，对每张切片中梗塞边缘区随机取10个高倍视野进行观察，各取双染阳性细胞数均值作为测定值。
       2.5  统计学方法使用SPSS统计16.0软件系统，所测数据以±s表示，多组间均数比较采用方差分析，两两比较采用LSD检验，P＜0.05为有显著性差异。方差不齐时采用Kruskal-Wallis检验。
       3  结果
       3.1  大鼠的在体心功能测定apr-YTF组的心功能4个指标较模型组均有显著改善（P＜0.01），LVSP、 LVEDP、+dp/dtmax和香丹组比较，差异具有显著性意义（P＜0.05或P＜0.01），LVSP较rhG-CSF组显著升高（P＜0.01）；rhG-CSF组的心功能4个指标较模型组均有显著改善（P＜0.05或P＜0.01）；香丹组的+dp/dtmax和模型组比较显著上升（P＜0.01）。结果见表1。表1  各组间心功能的比较(略)
       3.2  心肌组织的病理变化apr-YTF组和rhG-CSF组的心肌梗塞边缘区瘢痕组织内可见新生的心肌细胞和血管，恢复的趋势较为明显，而模型组和香丹组的心肌梗塞边缘区瘢痕内则很少见。结果见图1。
       3.3  大鼠心室肌瘢痕面积百分比apr-YTF组和rhG-CSF组的心室肌瘢痕面积百分比较模型组和香丹组显著减小（P＜0.01）。结果见表2。
       3.4  心肌组织中的CD34+细胞大鼠apr-YTF组和rhG-CSF组的心肌梗塞边缘区胞浆CD34+染色阳性的细胞数均显著高于模型组（P＜0.01），亦高于香丹组（P＜0.05或P＜0.01）；apr-YTF组和rhG-CSF组之间比较，差异具有显著性意义（P＜0.01）。结果见表2。
       3.5  心肌组织中Brdu与cTn I双染阳性细胞大鼠apr-YTF组和rhG-CSF组的心肌梗塞边缘区中Brdu与cTn I双染阳性的细胞数均显著高于模型组和香丹组（P＜0.01）；apr-YTF组和rhG-CSF组之间比较，差异具有显著性意义（P＜0.01）。结果见表2及图2。表2  各组间心室肌瘢痕面积百分比、梗塞边缘区胞浆CD34+染色阳性的细胞数、Brdu与cTn I双染染色阳性的细胞数比较(略)
       4  讨论
          
       MSCs具有保持未分化特性并无限增殖的能力，并且能够分化为包括心肌细胞在内的各种类型的细胞［7］。在急性心肌缺血状态下MSCs可以通过血液循环自行迁移到心肌损伤部位，参与坏死心肌组织的修复与再生，但由于归巢于心肌梗塞区的MSCs数量极少，其自我修复的作用也就极为有限［8］。因此，寻找能高效提高外周血液中MSCs的数量，并动员其定向归巢于损伤心肌的MSCs动员剂，成为一种迫切需要。Fukuhara等［9］ 利用rhG-CSF的动员作用，将小鼠骨髓细胞进行绿色荧光蛋白标记，分别于梗塞前3 d至梗塞后5 d给予rhG-CSF干预，结果发现，骨髓来源的绿色荧光蛋白标记的骨髓细胞部分呈现心肌细胞特异标志肌钙蛋白阳性。CD+34细胞是MSCs的特征性标志之一。
       
       本研究发现大鼠apr-YTF组和rhG-CSF组的心肌梗塞边缘区胞浆CD34+染色阳性的细胞数均显著高于模型组（P＜0.01），且两组之间的差异没有显著性意义（P＞0.05），提示apr-YTF具有和rhG-CSF相似的促进MSCs归巢于梗塞心肌的功能。
       
       瘢痕形成是机体创伤修复的必然产物，当机体组织受到一定深度的损伤后，创面先出现炎症反应，白细胞、巨噬细胞、肥大细胞等浸润，释放出多种细胞因子（生长因子），成纤维细胞和肌成纤维细胞大量增生并合成大量的胶原和基质，造成胶原代谢与排列的异常，异常基质的沉着，加上微循环和自由基因素的影响，促进了瘢痕的形成。心肌梗塞瘢痕区意味着没有成活的心肌细胞，也就丧失了正常心肌的功能。apr-YTF组和rhG-CSF组大鼠的心肌梗塞边缘区瘢痕组织内可见新生的心肌细胞和血管，较模型组大大加快了梗塞心肌的修复，因此从病理来看，瘢痕组织区域相应的比模型组要小，且两组之间的差异没有显著性意义（P＞0.05）。
       
       BrdU抗体不与胸腺嘧啶发生交叉反应，用免疫细胞化学染色就可观察BrdU在细胞内的掺入情况，故BrdU标记法的标记率高，检测准确性高，方法简便、迅速、安全，是反映细胞增殖及跟踪监测移植细胞的理想指标［10］。肌钙蛋白（cTn）是与心肌和骨骼肌收缩有关的调节蛋白，调节肌肉的收缩和舒张。cTn I仅在新生儿出生9个月之后在心肌中表达，而不在骨骼肌中表达，因此cTn I是心肌特异的抗原，具有优越的心肌特异性。因此，检测心肌梗塞区中Brdu与cTn I双染阳性的细胞能提示为MSCs归巢后转化为处于分化增殖状态的心肌细胞。apr-YTF组和rhG-CSF组大鼠的心肌梗塞区的双染阳性细胞数较模型组显著增多（P＜0.01），同样提示apr-YTF和rhG-CSF一样具有相似的促进MSCs归巢于梗塞心肌并转化为心肌细胞的功能，且两组之间的差异没有显著性意义（P＞0.05）。
       
       心肌细胞在缺血后可发生坏死和凋亡，一定面积的梗塞导致心功能下降。LVSP、+dp/dtmax是衡量心肌收缩能力和损伤程度的最常用指标，-dp/dtmax及LVEDP反映左心室舒张期顺应性和心肌僵硬度。apr-YTF组和rhG-CSF组大鼠的心功能4个指标较模型组均有显著改善，且apr-YTF组的LVSP较rhG-CSF组显著升高（P＜0.01），显示apr-YTF和rhG-CSF均具有改善急性心肌梗塞大鼠心功能的作用。无疑，促进心肌细胞再生，恢复梗塞心肌，缩小瘢痕是其重要的机制之一。由于rhG-CSF治疗急性心肌梗塞的原理在于动员MSCs归巢，促进血管和心肌细胞再生，而apr-YTF在动员MSCs归巢和改善心肌病理、心功能方面具有与rhG-CSF一致的功效，因此作者认为动员MSCs归巢是apr-YTF取得疗效的主要机制之一。
         
       养心通脉方，由人参、丹参、枳实、泽泻、桂枝等按一定比例组成，方中人参补已虚之元气，丹参活血化瘀，枳实理气消痰，泽泻利水而补阴不足，桂枝温经通脉，处方配伍可谓主次分明，切中本虚标实（尤其是气虚血瘀）的急性心肌梗塞病机。apr-YTF是由养心通脉方中提取出人参皂苷、丹参酮ⅡA、总生物碱、人参多糖、复方多糖、总挥发油等有效部位按一定比例组成的。根据参考文献［11～14］，本实验造模的大鼠具有急性心肌梗塞心血瘀阻证的中医证候特点，作者也观察到造模过程中有梗塞心肌的心脏变苍白，搏动无力，因此实际上具有微观辨证“气虚血瘀”的证候特点，而apr-YTF恰具有改善此证候实质的良好作用，具有行气活血作用的香丹注射液则远远不及益气活血的本方。
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