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       【摘要】 
       目的研究异甘草素(ISL)对氢过氧化枯烯(cumenehydroperoxide，CHP)诱导人神经母细胞瘤SH-SY5Y氧化损伤的影响。方法ISL处理体外培养的SH-SY5Y细胞24 h后，添加不同浓度的CHP继续培养24 h，进行细胞形态观察、细胞活力和细胞凋亡检测、细胞内活性氧(ROS)水平和丙二醛(MDA)含量测定。结果CHP引起并促进人神经母细胞瘤SH-SY5Y氧化损伤，ISL可拮抗CHP所致的细胞的凋亡，降低CHP所致的ROS水平和MDA含量的增高。结论ISL抑制脂质过氧化物的产生并降低细胞凋亡率，对人神经母细胞瘤SH-SY5Y氧化损伤有保护作用。
       【关键词】  异甘草素； 人神经母细胞瘤SH-SY5Y； 氢过氧化枯烯； 氧化损伤
       Effect of Isoliquiritigenin on the Cumenehydroperoxide-induced Damages in SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cells
       ZHANG Yuke,CUI Yurong, CHEN Peng,WANG Zhenhua,ZHENG Qiusheng
       （Key Laboratory of Xinjiang Endemic Phytomedicine Resources,Ministry of Education,School of Pharmacology, Shihezi University, Xinjiang Shihezi,832002,China）
       Abstract：Objective To study the effect of isoliquiritigenin on cumenehydroperoxide -induced oxidative damages in SH-SY5Y human neurobastoma cells.MethodsThe SH-SY5Y cells were pretreated with isoliquiritigenin for 24h, then treated by different concentrations of cumenehydroperoxide.Cell morphology was observed,neuronal apoptosis rate and survival rate were determined,the contents of ROS and malondialdehyde (MDA) were measured.ResultsCumenehydroperoxide was able to cause oxidative damage in SH-SY5Y cells.Isoliquiritigenin decreased the neuronal apoptosis rate, reduced MDA content and ROS level induced by cumenehydroperoxide.ConclusionIsoliquiritigenin can restrain the lipid peroxidation and neuronal apoptosis rate induced by oxidative stress. It has the protective effects against cumene hydroperoxide-induced oxidative damages in SH-SY5Y human neurobastoma cells.
       Key words： Isoliquiritigenin；SH-SY5Y；Cumenehydroperoxide；Oxidative damage
       过氧化氢、羟自由基等自由基产生和清除的动态平衡遭到破坏，引起氧化应激，从而造成生物大分子的氧化损伤，破坏细胞的结构和完整性［1］，最终导致细胞死亡。氧化应激造成大量活性氧(ROS)的产生是退行性神经疾病主要的病变机制［2］。寻找有效的抗氧化剂是对神经退行性疾病进行保护治疗的首要任务。CHP是一种稳定的亲脂性有机过氧化物，广泛应用于诱导细胞内的脂质过氧化和GSH/GSSG水平调节的研究［3］。国外对有机过氧化物引起脂类过氧化的研究主要集中于红细胞、微粒体及离体肝细胞等方面，但对神经细胞的影响尚无报道，因此研究用CHP诱导神经细胞产生氧化应激对研究神经退行性疾病有一定的理论意义。
       
       ISL是甘草中一种具有抗脂质过氧化、抗肿瘤及对脑缺血-再灌注损伤有一定的保护作用的单体化合物［4］，具有作为抗氧化剂开发的潜力。国内外关于甘草黄酮类化合物的清除自由基、抗氧化、抗促癌作用多有报道［5］。本研究探索ISL对CHP导致人神经母细胞瘤SH-SY5Y氧化损伤的保护作用。
       1  材料
          
       SH-SY5Y细胞株；DMEM培养基、CHP、还原型二氯荧光素-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)、［3-4,5-dimethylthiazol-2-yl］-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)、吖啶橙（Acridine Orange，AO）、溴化乙啶（EB）均购自Sigma公司；ISL购自江西本草天工科技有限公司；丙二醛(MDA)测试盒和考马斯亮蓝法蛋白浓度测试盒购自南京建成生工程研究所；特级胎牛血清购自杭州四季青生物工程公司；其余试剂均为国产分析纯。
       2  方法
       2.1  细胞培养和细胞损伤模型的建立SH-SY5Y细胞用含10%胎牛血清、100 U·ml-1青霉素、100 mg·L-1链霉素的DMEM培养基，于37℃，5%CO2条件下培养。CHP诱导SH-SY5Y细胞损伤模型的制备参照文献［6］。培养的SH-SY5Y细胞随机分为：①对照组：不加任何处理；②模型组：细胞预培养24 h后，添加不同浓度CHP继续培养24 h；③ISL保护组：细胞预培养24 h后，分别添加终浓度为（2.5 μg·ml-1)的ISL培养24 h，然后添加终浓度分别为2，3，4，5 μmol·L-1的CHP继续培养24 h后，终止培养，留取培养液和细胞待测。
       2.2  细胞形态学观察和AO/EB染色待细胞生长汇合至80%，ISL（2.5 μg·ml-1)预处理24 h后，CHP（终浓度分别为2，3，4，5 μmol·L-1）再作用24 h，显微镜下观察细胞形态并收集细胞，制备细胞浓度为107/ml的单细胞悬液。取细胞悬液100 μl，AO/EB染色后，封片荧光显微镜观察，于20 min内计数10个视野，每个视野50个细胞。
       2.3  细胞抑制率和IC50值的测定细胞生长抑制效应的测定采用MTT法［6］。细胞接种24 h后，一组分别添加2.5，5.0，10.0，20.0，40.0，80.0 μg·ml-1的ISL，测定ISL的IC50值；另一组分别添加1，10，20，30，40，50 μmol·L-1CHP，测定CHP的IC50值；以上两组细胞分别于37℃培养24 h，然后每孔加入MTT溶液10 μl(5 μg·ml-1)继续培养4 h后，终止培养。吸去培养板内上清液，每孔加入150 μl的DMSO，混匀并使结晶物溶解。多功能酶标仪于570 nm（630nm校准）波长下测定各孔吸光度存活率。
       
       存活率(%)=(OD试验组/ OD对照组)×100%
       
       根据药物浓度对应细胞增殖抑制率作线性回归，求药物对细胞增殖的IC50值。
       2.4  细胞内ROS水平的测定3.0×104个/ml细胞液加入96孔培养板中，在37℃，5%CO2 培养箱中培养24 h，换有不同药物处理因素的培养液培养到预定时间（见“2.2”项），加终浓度为10 mol·L-1DCFH-DA，孵育30 min后，PBS冲洗，在激发光波长485 nm，发射光波长525 nm测定荧光强度［7，8］。考马斯亮蓝法测定样品蛋白含量，以校正荧光值。
       2.5  细胞内MDA含量的测定细胞经反复冻融裂解后，4℃离心（10 000×g，10 min）取上清液备用，按试剂盒说明书进行测定。
       2.6  数据处理数据以±s表示，以t检验进行统计学分析。
       3  结果
       　　
       3.1  细胞形态学变化
       3.1.1  ISL对SH-SY5Y细胞形态的影响相差显微镜观察结果：正常对照组：细胞数量多，生长成梭形，突起致密（图1）；损伤模型组：细胞数量减少体积变小，突起稀疏（见图2）；ISL保护组：ISL对不同浓度的CHP有着不同程度的影响，ISL可减弱CHP对细胞造成的毒性作用（见图3）。
       
       3.1.2  AO/EB双染后荧光显微镜观察对照组：细胞核的DNA为黄绿色均匀荧光（图4）；损伤模型组：细胞出现凋亡，细胞核或细胞质内可见致密浓染的黄绿色荧光，浓聚成新月形或颗粒状，位于细胞的一侧，胞膜有突出小泡（图5）；ISL保护组：细胞核致密浓染的黄绿色荧光有所减弱，细胞核形态与正常细胞相似（图6）。
       AO/EB双染色荧光显微镜观察可将细胞分为：正常活细胞(viable non-apoptotic cell,VNA)、早期凋亡细胞(viable apoptotic cell,VA)、晚期凋亡细胞(non-viable apoptotic cell,NVA)和坏死细胞(non-viable non-apoptotic cell,NVNA)。细胞毒性按以下公式计算：Cytotoxicity%=(VA+NVA+NVNA)/Total cell count×100%（ISL预处理对不同浓度CHP作用后的各组细胞毒性率见表1）。表1  ISL对CHP诱导细胞毒性的影响(略)
       3.2  细胞活力测定结果培养细胞进入对数生长期后，分别加入不同浓度的CHP和ISL，作用24 h，MTT细胞活性检测结果如图7和图8所示：当CHP浓度增至4.3 μmol·L-1时，细胞存活率明显下降，为51.001%±5.021%，通过计算知道，CHP的IC50值为4.3μmol·L-1。ISL在2.5 μg·ml-1时，细胞存活率无明显变化，ISL的作用浓度为2.5 μg·ml-1。
       
       2.5 μg·ml-1的ISL孵育细胞24 h后，添加CHP（同模型组）。MTT检测细胞活性，如图9所示，随CHP浓度的增加，细胞生长的存活率逐渐降低，而在相同浓度的CHP条件下，ISL保护组存活率显著高于CHP组(P<0.01)，提示ISL对CHP所致SH-SY5Y细胞损伤有保护作用。
       3.3  ISL对CHP诱导SH-SY5Y细胞内ROS的影响不同浓度的CHP处理细胞24 h后，以DCFH-DA荧光探针测定各组细胞内ROS的水平。如图10所示，对照组荧光强度较弱，而CHP处理组荧光强度则较强，表明CHP导致了ROS水平升高；ISL保护组荧光强度较弱，表明ISL对CHP引起细胞内的氧化应激具有一定的保护作用。
       3.4  CHP对SH-SY5Y细胞内MDA水平的影响CHP以0，2，3，4，5 μmol·L-1处理细胞24 h后：细胞裂解后的上清中MDA的含量呈现剂量依赖趋势升高，（与对照组相比P<0.01）（见表2），表明CHP能够诱导SH-SY5Y细胞发生脂质过氧化反应。ISL保护组与模型CHP处理组相比，其细胞内的MDA水平呈现一定的下降趋势，显示了ISL具有一定的拮抗CHP诱导的脂质过氧化作用。表2  ISL对SH-SY5Y细胞内MDA产生的影响(略)
       4  讨论
           　
       神经细胞强烈依赖有氧代谢进行能量供应，对氧极为敏感。氧化应激是引起神经细胞凋亡的重要原因。受氧化损伤较重的神经细胞，以急性坏死为主，而受损伤相对较轻的神经细胞，以神经细胞凋亡为主。实验结果显示，2 μmol·L-1CHP干预时，细胞凋亡无明显变化，4 μmol·L-1的CHP使细胞凋亡明显升高。2.5 μg·ml-1的ISL预处理SH-SY5Y细胞后，可不同程度地减弱细胞所受的氧化损伤。
         
       中枢神经系统含有大量的不饱和脂肪酸，易发生脂质过氧化反应，生成大量的脂质过氧化物。CHP引发脂质过氧化，导致神经细胞收缩和形态结构尤其是生物膜系统的损伤，从而引起内源性抗氧化系统｛超氧化物歧化酶（SOD）、还原型谷胱甘肽过氧化酶（GSH-Px）等｝过度损耗，导致细胞功能紊乱，最终使神经元坏死。其中多不饱和脂肪酸过氧化产物MDA含量的增加，可作为细胞所受脂质过氧化的标志物。本实验制备了神经细胞氧化损伤模型，在细胞水平上联合检测MDA含量及细胞内ROS的水平，从相关联的两方面探索了异甘草素对细胞内清除自由基、脂质过氧化反应程度的影响。结果提示，在低浓度CHP作用时，细胞内MDA和ROS水平与对照组无明显变化，其原因可能是CHP作用的时间不足；在高浓度CHP作用时，细胞MDA和ROS水平显著升高。异甘草素干预可明显降低细胞内MDA含量和ROS水平，表明ISL通过清除细胞内自由基保护细胞膜，减弱神经细胞的氧化损伤。
       
       甘草黄酮具有明显清除自由基，拮抗脑组织脂质过氧化的作用，对Fenton反应生成的羟自由基也具有较强的直接清除作用［6］。ISL作为甘草黄酮类化合物的一种，可能通过在脂质过氧化过程中，二氢黄酮母环上的酚羟基与氧自由基反应而形成稳定的苯氧基，及异甘草素螯合羟(基)的羰基或邻位的羟基，消除自由基或淬灭超氧自由基，终止自由基的连锁反应从而达到抗氧化作用［6，9］。ISL对脂质过氧化反应终产物MDA的生成具有明显抑制作用。这些结果提示ISL对神经细胞损伤具有明显保护作用，但ISL神经保护作用确切的分子机制及其在整体水平的神经保护作用仍需进行深入研究探讨。
       【参考文献】
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