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       【摘要】 
       目的建立薏苡药材茎中甲醇部位的RP-HPLC指纹图谱的研究方法。方法采用Kromasil C18色谱柱（Dikma 公司，4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇-水为流动相梯度洗脱，流速1 ml·min-1，柱温30 ℃，检测波长263 nm。结果用梯度洗脱得到的色谱图各色谱峰分离较好，达到指纹图谱要求。10个产地薏苡药材共标定了12个共有峰。结论该方法简便、实用、可靠,可以作为评价薏苡药材质量的基础。
       【关键词】  薏苡； 高效液相色谱； 指纹图谱
       Chromatogram by Fingerprint of Coix lacryma-jobi L. var. mayuen (Roman.) Stapf
       LI Houcong，YUAN Wei，LI Ying， LIU Yuan
        
       （Medical School of Hubei Institute for Nationalities, Enshi 445000, China;  Ethnic Pharmacologial Institute of Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041，China）
       Abstract：ObjectiveTo establish reversed - phase high performance liquid chromatography(RP - HPLC) for determination of fingerprint of C. lacryma-jobi L. var. mayuen (Roman.) Stapf. Methods The sample was separated on a Kromasil C18 (4.6 mm ×250 mm ,5 μm) column with gradient elution. The mobile phase consisted of methol and water. The flow rate was 1.0 ml·min- 1 ; the temperature of column was at 30 ℃; UV detection wavelength was at 263 nm, and recording time was 75 min. ResultsHPLC chromatogram by Fingerprint of C. lacryma-jobi L. var. mayuen (Roman.) Stapf was obtained. 12 common peaks in the HPLC profile were found in C. lacryma-jobi L. var. mayuen (Roman.) Stapf in 10 different growing areas. ConclusionThis method is simple , practicable and reliable and can be used for the quality control of C. lacryma-jobi L. var. mayuen (Roman.) Stapf .
       Key words：C. lacryma-jobi L. var. mayuen (Roman.) Stapf ;   RP-HPLC；  Fingerprint
       薏苡为禾本科薏苡属植物薏苡C. lacryma-jobi L. var. mayuen (Roman.) Stapf和川谷C. lacryma-jobi L.的干燥全草、果实和种仁。
         
       《中国药典》从1963年版开始收载禾本科植物薏苡C.lacryma-jobi L.var.mayuen (Roman.) Stapf的干燥成熟种仁；2005年版记载薏苡仁粉末的鉴别、油脂类成分的薄层鉴别和甘油三油酸酯的含量测定项；功效为健脾渗湿、除痹止泻、清热排脓；用于水肿、脚气、小便不利、湿痹拘挛、脾虚泄泻、肺痈、肠痈；扁平疣的治疗［1］。薏苡根收载于上海市中药材标准1994年版中，有清热、利尿和驱虫作用［2］。
         
       薏苡的根、茎、叶、果实、种仁等药用部位在中国的蒙古族、藏族、苗族、彝族、侗族、佤族、傈僳族、傣族、壮族、毛难族、瑶族、哈尼族、景颇族、水族、基诺族等民族中均有大量使用［3］，而现有文献中关于薏苡根、茎、叶的研究涉及较少。
         
       有研究报道［4］表明薏苡抗肿瘤活性成分主要集中在甲醇部位，甲醇部位化学成分复杂，为更好地控制薏苡药材的质量，本文采用HPLC-DAD法建立了薏苡非种仁部位的指纹图谱，为薏苡非种仁部位（根、茎和叶）药材的质量控制提供新方法，为正确、科学和合理开发利用等方面提供一定的实验依据。
       1  材料与仪器
       1.1  试剂与材料甲醇为色谱纯（美国迪马公司）；水为重蒸水；其他试剂均为分析纯。实验所用药材，室温阴干，经刘圆教授、戴斌、彭朝忠副教授鉴定。来源见表1。表1   薏苡药材来源（略）
       1.2  仪器Waters2695 高效液相色谱仪；Waters2996 DAD检测器（美国Waters公司）；Empower Pro色谱工作站；KQ-250B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；METTLER AE240电子分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版；DPS2000 数据处理系统。
       2  方法
       2.1  色谱条件色谱柱：Kromasil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水梯度洗脱，甲醇为A相，水为B相，梯度洗脱表见表2；流速1 ml·min-1；柱温30 ℃；检测波长263 nm；分析时间75 min。表2  梯度洗脱（略）
       2.2  样品溶液的制备 称取薏苡药材粉末约1 g，过60目筛，精密称定，准确加入10 ml的甲醇，称重，超声提取30 min，放冷加甲醇补足损失重量摇匀，过滤，滤液蒸干，用10 ml甲醇溶解并定容，吸取滤液，过微孔滤膜(0.45 μm)，取续滤液备用。
       2.3  方法学考察
       2.3.1  精密度实验取10号供试品溶液，连续进样5次，测定12个主要色谱峰(特征峰的保留时间和峰面积比值)，结果表明各主要色谱峰的相对保留时间RSD＜2 %，峰面积RSD＜10 %，表明精密度良好。
       2.3.2  稳定性实验取10号供试品溶液，分别于2，8，16，24，48，72 h检测指纹图谱，记录各主要色谱峰保留时间及峰面积比值。结果表明各色谱峰的相对保留时间RSD＜2 %，在12个共有峰中有9个峰的峰面积RSD接近或超过10%，通过分析数据发现供试品溶液在48 h内稳定。
       2.3.3  重复性实验取五块石薏苡药材根茎粉末5份，每份1.0 g，精密秤定，按“2.2”项下样品溶液的制备方法制备供试液，检测指纹图谱，记录12个主要色谱峰的保留时间和峰面积比值，结果表明各主要色谱峰的相对保留时间RSD均在1 %以内，说明重复性良好。
       3  结果
       3.1  共有峰的标定对上述条件下的液相色谱指纹图谱分析比较，找出比较稳定的共有峰共12个。见图1。
       3.2  共有峰和重叠率计算在计算重叠率时，以第1批样品色谱指纹图谱作为标准药材，其他批次的药材与其对照来计算共有峰和重叠率。共有峰的结果见表3。表3  10批样品的色谱指纹图谱共有峰的相对峰面积（略）
       将各样品的相对保留值均一一列出，可清楚的看到他们之间的共有峰情况，同时可计算出各批样品中峰的重叠率。色谱指纹图谱重叠率(Rate of overlap: Rov)是从质的角度考虑待测样品与标准样品之间的相关性。其计算公式为:重叠率（%）=（共有峰数×2）/（标准药材峰数+待鉴药材峰数）×100 %。
       
       计算得10个批样品的重叠率从第1批到第10批分别为100%，59.65 %，64.62 %，64.71 %，58.06 %，63.49 %，80.56 %，72.73 %，86.37 %，64.62 %。
       3.3   八强峰色谱指纹图谱八强峰是指某样品的色谱峰中相对面积值Sr较大的前8个色谱峰。通过分析八强峰的数据可以以量的角度对比不同批样品和不同部位之间的差异。其八强峰结果见表4。表4  八强峰结果（略）
       从表4可以看出，上述八强峰的峰面积百分比均低于80 %，八强峰的含量较低。其中相对保留值α为1.000、0.277的峰为10批样品的共有峰，表明这两种组分为薏苡的最主要组分。α值为0.376和3.864的色谱峰为10个样品所共有，其中该峰有7个样品已进入八强峰。10批样品的八强峰顺序有很明显的差别。
       3.4  特征指纹峰在样品中均存在的色谱峰可以认为是该品种所特有，被称为特征指纹峰。特征指纹峰的入选条件，首先应该是全部样品所共有，其次是90%以上样品所共有。
       
       根据特征指纹峰的选择原则，确定10批或9批药材所共有的色谱峰为薏苡药材的特征指纹峰。符合以上条件的色谱峰共有13个。这13个特征指纹峰包括了2个八强峰。这13个色谱峰可作为判断薏苡的群体特征峰。其余色谱峰为部分样品所共有，可作为不同样品的特征峰。
       3.5  相似度采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》对各批样品色谱图的原始数据文件进行分析，以10批样品生成的对照谱图(平均值法)作为对照模板，计算各色谱图的整体相似度。10批被测样品的指纹图谱和测定结果见表5。表5  10批样品的相似度计算结果（略
       从表5可以看出，除S2、S5、S8外其他7个批次的药材相似度均在0.88以上，其他7个批次甲醇提取部位的相似度较高。
       4  讨论
       4.1  样品制备方法及检测条件的考察分别考察了甲醇回流、甲醇超声、氯仿浸润甲醇超声、氯仿超声甲醇溶解、甲醇超声后挥去甲醇再用甲醇溶解等方法制备样品，结果选择甲醇超声后挥去甲醇再用甲醇溶解的方法制备的供试品，峰面积较大,且能够较全面的反映薏苡药材中化学成分的信息，效果较好，故采用甲醇超声后挥去甲醇再用甲醇溶解的方法。
       
       本实验采用甲醇—水梯度洗脱系统,分别考察了0.8, 1.0, 1.2 ml·min-1  3个流速, 1.0 ml ·min-1  分离效果较好；分别考察了15, 25, 35 ℃柱温时的分离效果, 30 ℃柱温时分离效果较好。
       4.2  检测波长的选择在按“2.2”项制备样品溶液，在“2.1”色谱分离条件下,对薏苡甲醇提取物进行了PDA 200～400 nm紫外扫描, 参考波长—时间—吸收强度三维色谱图，并比较不同波长的色谱图，主要考察色谱图丰度、基线稳定情况，最后选择波长为263 nm。
       
       用建立的分析方法分别测定了10批不同产地的薏苡药材甲醇提取部分的指纹图谱，并用特定的数字化技术对HPLC指纹图谱中的数据进行分析和处理，确定了薏苡药材的12个特征指纹峰，计算了10批药材的重叠率和相似度。研究结果表明，用重叠率和相似度评价，结果基本一致，但并不完全相同。通过对各批药材的指纹图谱测定结果的分析，发现不同产地间药材差异很大，提示产地对薏苡药材的质量有很大的影响。
       【参考文献】
         　　［1］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社, 2005:260.
       
       ［2］李杨汉．禾本科作物形态解剖［M］．上海：上海科技出版社，1979：488．
       
       ［3］贾敏如，李星炜．中国民族志要［M］．北京：中国医药科技出版社，2005：174．
       
       ［4］Chang,H.C,Y.C.Huang,W.C.Hung. Antiproliferactive and chemopreventive effects of adlay seed on lung cancer in Vitro and in Vivo ［J］.J.Agric.Food Chem. 2003,51: 3565.