文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的研究甘松挥发油对大鼠心室肌细胞膜L型钙通道的影响，探讨甘松挥发油在离子通道水平抗心律失常的作用机制。方法用急性酶解法分离大鼠心室肌细胞，采用全细胞膜片钳记录技术，观察不同浓度的甘松挥发油对L型钙通道的影响。结果浓度为3，5，10，20，50 μg/g甘松挥发油可浓度依赖性地抑制L型钙电流，在浓度为10μg/g时，给药后电流密度抑制约为（45.7±3.5）%(n=5,P<0.01), 可使心肌细胞L型钙电流-电压曲线上移，但激活电位、峰电位及反转电位无改变；使激活曲线向正电位方向变化，V1/2从(-5.47±0.50)mV右移至(-2.77±0.49)mV(n=5，P<0.05)；使失活曲线向负电位方向变化, V1/2从(-20.82±0.48)mV左移至(-29.44±1.03)mV(n=5，P<0.05)。结论甘松挥发油可通过浓度依赖性地抑制大鼠心肌细胞膜L型钙通道电流，使I-V曲线上移；使激活曲线右移，使失活曲线左移。
       【关键词】  甘松； 膜片钳； L型钙通道； 心室肌细胞
       Effects of the Volatile Oil of Nardostachys chinensis on L-Type Calcium Channel in Isolated Ventricular Myocytes in Rats
       CAO Ming, GE Yuzhi，LUO Jun, WANG Yunxia, ZHANG Shuhua, WU Zhiting
       (Department of Cardiology,Jiangxi Provincial People’s Hospital, Nanchang 330006 China)
       
       Abstract：ObjectiveTo observe the effects of the volatile oil of Nardostachys chinensis on L-Type Calcium channel in isolated ventricular myocytes of rats.MethodsSingle ventricular myocytes of rat were obtained by enzymatic dissociation method．The whole—cell patch clamp recording technique was used to record the change of L-Type Calcium channel current by diferent dosage of the volatile oil of Nardostachys chinensis from 3to 50ppm.ResultsThe volatile oil of Nardostachys chinensis decreased L-type calcium channel current in a dose—dependent manner. The volatile oil of Nardostachys chinensis (10μg/g) decreased the current density by 45.7％ (n=5,P<0.01),the current—voltage curve was moved up and active potential，peak potential and reverse potential had no change．The activation curve was moved to more positive potential and the inactivation curve moved to more negative potential．ConclusionThe volatile oil of Nardostachys chinensis decreases the L-Type Calcium channel current in a dose—dependent manner,the current-voltage curve was shifted upward,the activation curve was shifted towards the depolarizing direction and the inactivation curve was shifted towards the hyperpolarizing direction.
       Key words：Nardostachys chinensis；  Patch-clamp techniques；  L-Type Calcium channel；  Myocardial cell
       甘松为败酱科甘松属植物，甘松挥发油是甘松有效浓缩成分［1］，主要分布在四川、甘肃、青海等地。其抗心律失常机制已有初步的研究［2］，我们发现甘松挥发油对快钠通道（INa）以及瞬时外向钾通道(Ito)均有浓度依赖性抑制作用，本研究应用膜片钳全细胞记录技术，观察甘松挥发油对大鼠心室肌细胞膜L型钙通道(ICa-L)的影响，从离子通道水平探讨其作用机制。
       1  材料和方法
       1.1  材料健康成年雌雄性SD大鼠，体质量200～300 g，由南昌大学医学院动物所提供。甘松挥发油由阴干后的甘松样品1 000 g，按《中国药典》（Ⅰ部）甲法进行水蒸馏，经6 h后停止加热，静置过夜，油水相分离后得浅绿色油状液体［3］,再将已提取好的甘松挥发油按1∶3的比例用二甲基亚砜溶解，再与ICa-L细胞外液相溶。
       1.2  膜片钳记录仪器与设备膜片钳放大器(Axopatch 200B)及DigiData 1200B型数/模（或模/数）转换器均为美国Axon公司产品，荧光倒置显微镜，03-D玻璃微电极拉制仪。　
       1.3  溶液配制无钙台氏液为(mmol/L)：NaC1 136，KC1 5.4，MgCl2 1．0，NaH2PO4 0．33，HEPES 10，glucose 10，NaOH调pH至7．4。 KB液为(mmol／L)：KC1 40，KH2PO4 20，MgSO4 3.0，KOH 80，谷氨酸50，牛磺酸20，HEPES 10，glucose 10，EGTA 0．5，KOH调pH至7．4。ICa-L细胞外液为正常台式液（比无钙台式液增加CaCl2 1.8）。ICa-L电极内液为(mmol/L)：CsC1 120，CaCl2 1.0，MgCl25.0，Na2ATP（3H2O） 5.0，EGTA 11，HEPES 10，Glucose 11，CsOH调pH至7．3。
       1.4  膜片钳全细胞记录方法选取纹理清晰、杆状和大小适中的细胞在室温下（23～26℃）进行实验，当电极达到高阻抗封接时，通过补偿快电容并吸破细胞膜形成全细胞记录模式，调节慢电容补偿和串联电阻补偿以减少瞬时充放电流和钳制电位误差。信号发放与采集均由软件完成并存储于计算机硬盘中，供测量及分析用。为消除细胞间误差，电流值以电流密度(pA／pF)表示。
       1.5  统计学处理采用pCLAMP9．0软件对单个全细胞记录进行数据和图形转换，Origin7．5软件对数据进行曲线拟合及绘制浓度-剂量曲线，离子通道电流密度-电压曲线，电流密度(pA／pF)= 电流强度／电容；激活-失活关系曲线。所有数据以±s表示，用SPSS13．0统计软件做统计分析，采用配对样本t检验。
       2  结果
       2.1  型钙通道电流的记录细胞内液用Cs+代替K+阻断钾电流。将钳制电位(HP)设为-40mV使钠通道及T型钙通道失活，将钳制电位设为-40 mV，给细胞施与700 ms，从-40 mV到+60 mV的序列除极方波，刺激频率为10 Hz，步长10 mV，去极化脉冲刺激，诱发出内向电流ICa-L（图1A）。甘松挥发油10 μg/g作用3min后可见内向电流明显减少（图1 B）。用细胞外液灌流冲洗后部分细胞能完全恢复被抑制的钙电流（图1 C）。这可进一步说明内向L型钙电流的减少是该药物引起的。
       2.2  甘松挥发油对L型钙通道电流作用的量效曲线细胞钳制电位（holding potential,HP）控制在-40 mV,用含不同浓度的甘松挥发油细胞外液灌流，观察3,5,10,20,50 μg/g对大鼠心室肌细胞L型钙电流的影响，其抑制率分别为（11.18±1.48）%，（24.83±4.82）%,（45.72±3.54）%,（76.87±7.03）%,（100±0）%（每个浓度n=5，P<0.05）。用上述数据作图，然后采用I=ImaxCn/(Cn+EC50n)方程进行拟合，式中得到半数有效浓度EC50值为12.77±3.22，斜率因子为1.37±0.82。见图2 。
       2.3  ICa-L电流-电压（I-V）曲线测定在电压钳模式下，从HP-40 mV逐步除极至+60 mV，阶跃+10 mV，维持时间700 ms，刺激频率0.5Hz，以各激活电位下电流密度对相应电位作图得I-V曲线图，其中电流密度为各激活电位下电流与膜电容的比值，单位为皮安/皮法（pA/pF）。如图C所示，钳制电位为-40 mV，以10 μg/g甘松挥发油灌流液进行对照研究，可使电流-电压曲线明显上移。给药前后峰值电流从（-10.46±1.49）pA/pF减少至（-5.67±0.78）pA/pF(n=5，P＜0.01)。但不改变激活电位、峰电位、反转电位和曲线的形状。冲洗后部分细胞可以基本恢复，但对L型钙电流的激活电位、峰电位和翻转电位无明显影响。见图3。
       2.4  甘松挥发油对L型钙通道激活动力学影响为观察ICa-L的激活动力学特征，将I-V曲线的结果转换成膜电导（G），对条件刺激电压作图，然后采用Boltzmann方程G/Gmax=1/［l+exp(Vm-V1/2)/k］进行拟合, 式中得到ICa-L激活曲线，求得V1/2（半数激活电压）和S（斜率因子）。浓度为10 μg/g甘松挥发油使L型钙通道激活曲V1/2从(-5.47±0.50)mV右移至(-2.77±0.49)mV(n=5，P<0．05)，S从(4.68±0.39)mV减少至(4.50 ±0.40)mV(n=5，P>0．05)。见图 4。
       2.5  甘松挥发油对L型钙通道失活动力学影响采用双脉冲刺激法，保持电位-40 mV，从-60 mV逐步去极化至+40 mV，阶跃为10 mV，持续1s，在每一条件脉冲后紧跟一固定除极至0 mV，300 ms的测试脉冲，然后回到-40 mV，记录L型钙通道失活电流。以电流相对值对条件脉冲电压作图，经Boltzmann方程进行拟合：I/Imax=1/{l+exp［-(Vm-Vl/2)］/k}，得INa失活曲线，然后求得V1/2（半数失活电压）和S（斜率因子）。浓度为10 μg/g甘松挥发油使ICa-L失活曲线V1/2 从(-20.82±0.48)mV左移至(-29.44±1.03)mV(n=5，P<0．05)，S从(6.16±0.43)mV增加至(11.05±0.86)mV(n=5，P<0．05)。见图 5。
       3  讨论
        
       本实验室在过去的研究中发现，甘松挥发油可加快Na+的失活及抑制激活的作用［4］,均存在电压依赖性阻滞，包括Ito ,HEK细胞Nav1.5［5］，从而说明其是一个多通道的阻滞剂，也进而使我们产生了研究L型钙通道的设想。
       
       采用膜片钳技术可以直接观察细胞膜离子通道电流，是研究抗心律失常药物作用的靶点，阐明药物对离子通道活性影响以及抗心律失常作用机制的有效手段。本实验应用甘松挥发油研究其对大鼠心室肌细胞L型钙通道的影响，为避免ICa-L出现“rundown”现象，本实验在电极内液中加入EGTA缓冲钙离子及能量物质Na2ATP，并保证实验过程于15 min内结束，可减少“rundown”现象的影响。ICa-L主要参与心肌细胞动作电位的2期即平台期的电流组成，为一内向电流，增加ICa-L可延长APD以及升高平台期的电位水平，容易引起早期后去极化（EAD）以及延迟后去极化（DAD）,可导致心律失常的发生。
       
       通过本实验研究，结果显示，甘松挥发油可浓度依赖性抑制ICa-L，使I-V曲线上移，但不改变其激活电位，峰电位以及反转电位，提示甘松挥发油在不同膜电位都对ICa-L具有均匀一致的抑制作用。在外液灌流后，其电流可恢复70～80%，证明了“rundown”［6］现象的存在。甘松挥发油减少钙离子内流以及细胞内钙超载，可有效避免EAD，DAD的发生，这也可能是其抗心律失常的机制之一。本研究还发现，甘松挥发油使激活曲线右移，使失活曲线左移，显示甘松挥发油同时作用于L型钙通道的激活态和失活态，使激活减慢，失活加快。由于我们的研究已经证实甘松挥发油是一种多通道的阻滞剂，包括INa,Ito以及ICa-L,所以其抗心律失常作用应该是一个综合的结果，延长了APD及ERP。
       
       目前临床上广泛使用的稳心颗粒,其主要成分为甘松,而甘松挥发油为其提取成分,临床观察中发现稳心颗粒对心律失常有较好的疗效,本实验室从电生理的角度初步探明了其对抗心律失常的机制,最初发现其可以抑制动作电位0期的上升速度,即对构成动作电位0期的快钠通道具有抑制作用,而后对快速复极相(1期)具有抑制瞬时外向钾电流Ito［7］，而目前的研究证实其对动作电位2期平台期的L型钙电流亦具有浓度依赖性抑制作用，其对多个通道的共同作用延长了APD ,ERP产生了稳心颗粒临床观察中的良好效果。可以肯定膜片钳技术的普及对探明各种中药的抗心律失常作用机制起着至关重要的作用。
       
       由于甘松挥发油的挥发性，可通过吸入起作用，其相比于静脉及口服给药具有药物半衰期短，副作用小，携带方便，便于急救等优点。而对于甘松挥发油对其他通道如Ik1，Ikr，Iks，ICa-T是否都具有阻滞作用有待进一步研究，进一步明确各单体的作用对于今后开发特异性通道阻滞剂具有深远的意义。
       【参考文献】
         　　［1］Ken Tanaka,Katsuko Komatsu.Comparative study on volatile components of Nardostachys Rhizome［J］.Journal of Natural Medicines.2008,62:1340.
       
       ［2］葛郁芝，吴志婷，叶政助，等.甘松挥发油对心肌细胞内向电流的影响［J］.心肺血管论坛,2005,6:41.
       
       ［3］韩泳平,肖 丹,向永臣,等.甘松挥发油成分分析［J］.中药材, 2000，23(1)：34.
       
       ［4］葛郁芝，吴志婷，胡朗吉，等.中药甘松挥发油对HEK细胞Nav1.5电流电压及电导电压的影响［J］.时珍国医国药，2009，20(1):1.
       
       ［5］葛郁芝，吴志婷，张淑华，等.HEK细胞Nav1.5电流对中药甘松挥发油浓度及电压依赖性阻滞［J］. 中药药理与临床，2009，25（3）：30.
       
       ［6］李 泱.离子通道与膜片钳技术［M］. 兰州:甘肃文化出版社,2001：132.
       
       ［7］胡朗吉, 葛郁芝, 罗 骏,等.甘松挥发油对大鼠心室肌细胞瞬时外向钾电流的影响［J］. 时珍国医国药, 2009, 20(8):1843.