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       【摘要】 
       目的通过研究重楼皂苷类化合物的溶血作用，为重楼的进一步开发和利用提供依据。方法以分离纯化获得重楼总皂苷、偏诺皂苷PHAC-A和薯蓣皂苷PHAC-B为实验材料，经梯度稀释后用常规肉眼观察法和分光光度法测定样品对兔血红细胞的溶血度。结果当重楼总皂苷和(PHAC-A)在浓度大于等于50 μg·ml-1时、 (PHAC-B)浓度大于等于75 μg·ml-1时溶血率>5%，3种样品的溶血作用均表现出剂量依存关系。结论重楼皂苷中主要产生溶血作用的化合物为PHAC-A。重楼皂苷类化合物在特定浓度下不具有溶血作用，将其运用于静脉注射具有一定的可能性。
       【关键词】  重楼； 重楼总皂苷； 偏诺皂苷； 薯蓣皂苷； 溶血
       中药重楼为云南重楼Paris polyphylla Smith varyunnanensis(Franch.) Hand.-Mazz和七叶一枝花P. polyphylla Smith var. chinensis(Franch.) Hara的干燥根茎，在《本草纲目》中以蚤休之名收载，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊之功效。现代药理学研究表明，重楼具有止血、抗肿瘤、免疫调节、抑菌、镇痛等广泛的药理活性［1］，主要活性成分为甾体皂苷类化合物［1，2］。由于甾体皂苷是一类表面活性剂，有很强的乳化力，具有溶血通性，可使红细胞破裂给机体带来严重危害，极大地限制了重楼的临床应用进一步开发。近年有文献报道称重楼总皂苷可在一定剂量内运用于静脉注射［3］，因此，本文研究了重楼总皂苷和其中的两种主要皂苷类成分偏诺皂苷（PHAC-A）和薯蓣皂苷（PHAC-B）的溶血作用及其与剂量的相关性。
       1  材料与仪器
       1.1  仪器与试剂高效液相色谱仪（美国Agilent 1100），恒温水浴箱（土耳其NüVE），低温离心机（Eppendorf 5804R），酶标仪（美国SPECTRAmax 190），微量分析天平（瑞士梅特勒XS205DU）。试剂为国产分析纯。
       1.2  动物日本大耳兔，体质量2.5～3.0 kg，雌雄不限，由昆明医学院动物科提供。
       2  方法
       　　
       2.1  样品精密称取重楼总皂苷（由昆明学院天然产物研究所分离获得），置烧杯中，加约20～25倍（质量体积比）甲醇，超声波处理40 min，取出，放冷至室温后用甲醇稀释至含重楼提取物3%的浓度（质量体积比），摇匀滤过，收集滤液，使其通过SEP-PAK C18柱，以70%甲醇洗脱，收集洗脱液于水浴蒸干，作为供试品偏诺皂苷（PHAC-A），薯蓣皂苷（PHAC-B）。
       
       重楼总皂苷、PHAC-A，PHAC-B由昆明学院天然产物研究所鉴定，各样品主要成分含量﹥98%。其中PHAC-A包含偏诺皂苷元-3-O-α-L-鼠李吡喃糖-(1→4) -α-L-鼠李吡喃糖-(1→4) -［α-L-鼠李吡喃糖-(1→2)］ -β-D-葡萄吡喃糖苷、偏诺皂苷元-3-O-α-L-鼠李吡喃糖-(1→2) -［α-L-鼠李吡喃糖-(1→4)］ -β-D-葡萄吡喃糖苷、偏诺皂苷元-3-O-α-L-阿拉伯呋喃糖-(1→4) -［α-L-鼠李吡喃糖-(1→2)］ -β-D-葡萄吡喃糖苷和偏诺皂苷元-3-O-α-L-鼠李吡喃糖-(1→2) -β-D-葡萄吡喃糖苷，共4种偏诺皂苷。PHAC-B包含薯蓣皂苷元-α-L-鼠李吡喃糖-(1→2)- β-D-葡萄吡喃糖苷、薯蓣皂苷元-α-L-鼠李吡喃糖-(1→4)-β-D-葡萄吡喃糖苷、薯蓣皂苷元-β-D-葡萄吡喃糖苷和薯蓣皂苷，共4种薯蓣皂苷。
       2.2  2%红细胞悬液的制备取家兔新鲜血液20 ml，放入盛有玻璃珠的三角烧瓶中振摇约10 min，除去纤维蛋白原，制成脱纤血液，加100 ml生理盐水摇匀，1 500 r·min-1离心5 min，除去上清液，反复用生理盐水洗至上清液无红色，将所得红细胞用生理盐水配制成压积为2%的红细胞混悬液，备用。
       2.3  体外溶血的肉眼观察［4，5］取10 ml干净玻璃试管，编号并按顺序加入各种样品溶液，其中空白对照为生理盐水，阳性对照为蒸馏水。各管轻度摇动至均匀后，37℃水浴中孵育3 h，观察1～3 h内各管的溶血程度，以“+”表示完全溶血，“－”表示无溶血，“±”表示部分溶血。
       2.4  分光光度法测定体外溶血［4，5］取10 ml干净玻璃试管编号并按顺序加入100 μl各种样品溶液，再加入900 μl生理盐水和1 ml 2%压积的红细胞混悬液，其中空白对照为1 ml生理盐水和1 ml 2%压积的红细胞混悬液，阳性对照为1 ml蒸馏水和1 ml 2%压积的红细胞混悬液，每个样品浓度4个平行。各管轻度摇动至均匀，37℃水浴中温孵3 h后，离心，1 500 r·min-1离心5 min，每管取上清250 μl于96孔板中，用酶标仪进行测定。以空白对照管为空白，对阳性对照管进行全波长扫描，以阳性对照管的最大吸光度（545 nm）为选定波长读取各管吸光度（A）值。
       
       2.5  溶血率计算用下式计算各试验管的溶血率：
       
       溶血率（%）= 试验管吸光度阳性对照管吸光度×100%
       溶血率>5%表明出现了溶血，不宜应用于注射剂型［4，5］。
       3  结果
       3.1  体外溶血的肉眼观察将样品重楼总皂苷、PHAC-A，PHAC-B按比例稀释为具一定浓度梯度的供试样品液，通过肉眼观察其对红细胞的影响。结果见表1。表1  重楼皂苷类化合物的溶血作用（肉眼观察法）（略）
       
       实验结果表明，重楼总皂苷、PHAC-A和PHAC-B均观察到不同程度的溶血现象。当重楼总皂苷和PHAC-A大于50 μg·ml-1浓度时均产生了溶血，低于25 μg·ml-1浓度时未观察到溶血现象；而PHAC-B则在75 μg·ml-1浓度时观察到部分溶血现象，低于75 μg·ml-1的浓度均未出现的溶血。
       3.2  体外溶血的吸光度比较将样品重楼总皂苷、PHAC-A，PHAC-B按比例稀释为具一定浓度梯度的供试样品液，分组测定其对红细胞的影响，计算溶血率。结果见表2。表2  重楼皂苷类化合物的溶血作用（分光光度法）（略）
       实验结果表明，重楼总皂苷、PHAC-A和PHAC-B对红细胞的溶血作用与肉眼观测结果一致。当PHAC-B浓度大于75 μg·ml-1时溶血率>5%，而重楼总皂苷和PHAC-A浓度大于50 μg·ml-1时则溶血率>5%，不宜应用于注射剂型。
       4  讨论
          
       用分光光度法测定重楼总皂苷和PHAC-A,B对兔血红细胞的溶血率，与常规溶血试验法对照，结果一致。当薯蓣皂苷PHAC-B为浓度大于75 μg·ml-1时溶血率>5%，而重楼总皂苷和偏诺皂苷PHAC-A浓度大于50 μg·ml-1时溶血率>5%，不宜应用于注射剂型；3种样品的溶血作用均表现出剂量依存关系。由实验结果可以看出，重楼皂苷中主要产生溶血作用的化合物为偏诺皂苷类化合物。通过试验，初步确定重楼皂苷类化合物在特定浓度下不具有溶血作用，这与周满红等［3］报道的重楼总皂苷的溶血结果一致。由此看来，重楼活性成分运用于静脉注射剂型具有一定的可能性。
       
       天然药物制剂，包括活性成分或组分、体内代谢物、赋形剂、有关杂质及制剂的理化性质（如pH、渗透压等）均可能是导致给药部位产生毒性或溶血性的因素，局部用药的安全性又直接影响到患者的依从性，甚至影响到临床疗效。皂苷有使红细胞破裂的作用，称溶血性。皂苷在高等动物的消化道中因消化过程导致其结构改变，故口服无溶血毒性。皂苷有无溶血作用与皂苷元的种类有关，作用强弱与结合的糖有关。单糖链皂苷溶血作用一般较显著；双糖链皂苷中，苷元是中性三萜类的溶血作用较弱或无溶血作用；酸性皂苷溶血作用大于中性皂苷。皂苷的溶血作用与皂苷的浓度也有关，即具有浓度依赖性。例如以甾体皂苷为主的麦冬总皂苷具有溶血作用，但具有浓度依赖性。皂苷溶血作用的机制是其可与红细胞膜上的胆甾醇结合形成不溶性的分子复合物，破坏红细胞的正常渗透压，使细胞内渗透压增加而发生崩解，从而引起溶血。然而，并不是所有的皂苷都能破坏红细胞而产生溶血作用，例如人参皂苷无溶血现象，但经分离后，其中以人参萜三醇及齐墩果酸为苷元的人参皂苷具有显著溶血作用，而以人参二醇为苷元的人参皂苷则具有抗溶血作用［6］。重楼含有多种甾体皂苷，其中以薯蓣皂苷元的糖苷和偏诺皂苷元的糖苷为主要存在形式，也是重楼的主要活性成分，薯蓣皂苷元和偏诺皂苷元属于甾体皂苷中的异螺甾烷醇类，F环闭合（F环裂解则无溶血作用），以单糖链皂苷形式存在，虽然为中性皂苷，但因其只有一条糖链，且其与胆甾醇形成的分子复合物较三萜皂苷稳定，因此表现出较强的溶血特性。
       
       不论是重楼总皂苷还是重楼皂苷中经分离纯化获得的PHAC-A和PHAC-B均具有溶血作用，同时表现出明显的浓度依赖性，随着试液浓度的增加溶血率也增加。从实验结果来看，一定浓度的重楼总皂苷、PHAC-A和PHAC-B不具有溶血作用，这使重楼皂苷从静脉途径使用具有了一定的可行性，即在一定剂量范围内使用是较为安全的。作为甾体皂苷类化合物的重楼皂苷，除了溶血作用以外还可能存在其它毒性，对于其是否能成为静脉注射剂进入临床使用有待作进一步研究。
       【参考文献】
         　　［1］武珊珊，高文远，段宏泉，等.重楼化学成分和药理作用研究进展［J］.中草药，2004，35(3):344.
       
       ［2］边洪荣，李小娜，王会敏.重楼的研究及应用进展［J］.中药材，2002，25(3):218.
       
       ［3］周满红，李建国，王瑞烈，等.重楼总皂苷溶血作用实验研究［J］.中国药房，2007，18(21):1611.
       
       ［4］崔亚男，王东凯，邱志斌.两种溶血性试验方法在复方参芍注射剂研究中的应用［J］.中国药房，2007，18(3):182.
       
       ［5］李仪奎.中药药理实验方法学，第2版［M］.上海:上海科学技术出版社，2006:1055.
       
       ［6］姚新生.天然药物化学，第3版［M］.北京:人民卫生出版社，2002:320.