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       【关键词】  黄连；,,SDS-PAGE；,,可溶蛋白；,,电泳鉴别
       摘要：目的对雅连、峨眉野连、云连及6个不同产地的味连进行电泳鉴别。方法采用SDS-PAGE电泳方法。结果味连与雅连具有显著差异，味连与峨眉野连之间几乎无差异，不同产地的味连差异小，云连仅一条极弱的条带。结论SDS-PAGE电泳可以作为黄连质量控制的鉴别依据。
       关键词：黄连；  SDS-PAGE；  可溶蛋白；  电泳鉴别
       The Analyses of Soluble Protein in Rhizoma Coptidis by SDS-PAGE Electrophoresis 
       CHEN Da-xia ,LI Long-yun,QU Xian-you ,QIN Song-yun , ZHONG Guo-yue
       （Chongqing Academy of Chinese Materia Medica,Chongqing 400065, China）
       Abstract:ObjectiveThe soluble protein of Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao.、Coptis 0meiensis.、 Coptis teeta Wall. and Coptis chinensis Franch. which come from different region were identified.  MethodsProtein electrophoresis technology SDS-PAGE was applied .ResultsThe experiment shows that there were obvious differences between Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao.and Coptis chinensis Franch.、little difference between  Coptis omeiensis.and Coptis chinensis Franch.、a little difference between Coptis chinensis Franch. from different region. There was only one weak band in Coptis teeta Wall.ConclusionSDS-PAGE electrophoresis method can identify quality stability of Rhizoma Coptidis.
       Key words:Rhizoma Coptidis；  SDS-PAGE；  Soluble protein；  Electrophoresis
   
　　黄连是毛茛科多年生草本植物，以根茎入药，性寒味苦，为中药要药，《神农本草经》列之为上品，商品有味连（Coptis chinensis Franch．）、雅连（Coptis deltoidea  C．Y．Cheng et Hsiao．）、云连（Coptis teeta Wal1．），三者在外形上较为相似，目前对黄连的鉴别主要有来源、性状、显微、薄层色谱等定性鉴别以及薄层扫描、高效液相色谱、胶束色谱、高效毛细管电泳、紫外分光光度法等定量分析 ［1~3］。在蛋白质电泳鉴别方面，仅石俊英等［4］将黄连与其他根及根茎类、果实种子类15种标准药材进行了 PAGE电泳鉴别，应用 SDS-PAGE电泳对黄连进行鉴别目前尚未见报道。本研究对雅连、峨眉野连、云连及不同产地味连进行了 SDS-PAGE电泳分析，旨在为中药材的质量控制提供一项可行的鉴别指标，为中药材蛋白指纹图谱的建立奠定基础。
       　　1  材料、仪器及试剂
       1.1   供试材料材料见表1，由本院生药栽培室研究员李隆云鉴定。味连、雅连、峨眉野连于200411收集，黄连根部洗净后，置于50℃烘箱内烘至完全干燥，最后密封保存于干燥室。云连采于1985年，由本院标本馆保存。表1  材料来源编号（略）
       1.2   仪器 DYY-Ⅲ 1型稳压电泳仪（北京六一仪器厂）、TS-2型脱色摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）、3K30高速冷冻离心机（Sigma）、Gel Doc 2000凝胶成像系统（BIO-RAD公司）。
       1.3   主要试剂 
       丙烯酰胺、双丙烯酰胺、SDS、硝酸银、37%甲醛、甘油、考马斯亮蓝 R-250均为 BBI公司产品，硫代硫酸钠、碳酸钠、甘氨酸为 Amersco产品，TEMED、过硫酸铵为 Promega产品，蛋白质低分子量标准为 TakaRa产品，其余均为国产分析纯试剂。
       　　2  实验方法
       2.1   试剂配制及凝胶制备
       参照文献［5，6］进行。浓缩胶浓度4%，分离胶浓度15%。
       2.2  样品制备 
       去除黄连根表面的须根及老皮，称取0.5 g样品，充分研磨成细粉状。置于冰上，加入4℃放置的50 mMTris-Cl (pH 9.5) 3 ml，研磨成匀浆，静置30 min，转移至离心管中，离心20 min（12 000 r/min，4℃），取上清加入粒状活性炭吸咐色素，并将上清浓缩至1 ml；取上清按4∶1的比例加入 5×SDS-PAGE上样缓冲液，置沸水中煮3~5 min，用于 SDS-PAGE电泳分析。
       2.3   电泳
       参照文献［6］进行。上样量10 μl，初始电压100 V，待溴酚蓝指示剂到达分离胶位置时，加大电压至170 V。当溴酚蓝指示剂迁移到距凝胶前沿1 cm时，停止电泳，取出凝胶。
       2.4   染色及图谱分析
       银染参照文献［6］进行。染色后，在凝胶成像系统上检测、照相、记录。结果见图1。
       
　　3  结果与讨论
 
　　黄连SDS-PAGE电泳图谱见图：整体上观察，电泳图谱清晰。根据分子量及谱型，可分3个区，A区分子量在44.3KDa以上，有两条谱带；B区分子量在44.3~20.1 KDa之间，具有3条谱带；C区分子量在20.1 KDa，具有两条谱带，其中鉴别特征条带位于B、C两个区。从图中可看出：除重庆石柱与陕西镇坪两个产地的味连在97.2 KDa之上有条带外，不同产地的味连之间差异并不显著；峨眉野连与味连之间无明显差异；味连、峨眉野连与雅连之间的差异明显，主要的强条带集中于29KDa左右，从条带的有无看，共有带为A2，B1，B2，但在表达量上仍有细微差异，B3，C1，C2为味连和峨眉野连特有，可作为它们的特征鉴别带；雅连正常株与变异株之间基本无差异；云连仅在29 KDa有一条极弱条，分析可能与云连存放时间过长导致蛋白质严重降解有关，这就提示我们，在对药材进行蛋白质电泳鉴别时，需注意药材存放时期及贮存条件对电泳图谱的影响。
       本实验谱带清晰，分辨率高，重复性好，可作为黄连质量控制的鉴别依据。
       　　参考文献：
       ［1］尹清.HPLC测定黄连中盐酸小檗碱含量［J］.上海中医药杂志，2003，37(7)：7.
       ［2］方清茂,张浩,李章才,等.RP-HPLC测定不同品种黄连中的黄连碱和表小檗碱［J］.华西药学杂志，2003，18(4)：290.
       ［3］乔梁，周洪雷，魏璐雪，等.高效毛细管电泳测定黄连配伍阿胶中黄连生物碱的含量［J］.北京中医药大学学报，1 999，22(4) ：25
       ［4］石俊英，彭艳丽，韩宁，等.16种中药的电泳鉴别研究［J］.山东中医药大学学报，1997，21(1)：66
       ［5］郭尧君.蛋白质电泳实验技术［M］.北京：科学出版社，1999：132
       ［6］汪家政，范明.蛋白质技术手册［M］.北京：科学出版社，2000：77.
       基金项目：国家科技攻关计划资助项目（No.2004BA721A32）
       
　　重庆市应用基础研究资助项目
       作者简介：陈大霞(1968-)，女(汉族)，重庆人，现任重庆市中药研究院助理研究员，硕士学位，主要从事药用植物分子生物学及生药栽培研究工作．
       (重庆市中药研究院，重庆  400065)