三波长分光光度法测定多穗柯叶中黄酮的含量
作者：肖坤福
《时珍国医国药》 2006年 第6期
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【关键词】 黄酮类化合物；,,多穗柯；,,三波长分光光度法
摘要：目的清除由于多穗柯叶中黄酮光谱吸收峰不对称给定量分析造成的影响。方法采用三波长分光光度法测定多穗柯叶中黄酮含量。结果回归方程为△A=0.038 4C+0.001 3；相关系数R=0.999 5；检测波长λ1=460 nm，λ2=420 nm，λ3=380 nm，线性范围为500~3 000 μg/ml，回收率为96.6%~106.2%，变异系数小于0.43%。结论该方法的准确度和精密度均令人满意，且操作简便易行。
关键词：黄酮类化合物； 多穗柯； 三波长分光光度法
Determination of Flavonoids in Lithocarpus Polysachyus rehd Leaves by Three-wavelength spectrophotometry
XIAO Kun fu
(College of Lishui,Lishui, Zhejiang 323000, China)
Abstract：ObjectiveTo solve the infection of asymmetric absorption peak in determination of flavonoids in lithocarpus polysachyus rehd leaves.MethodsDetermination of flavonoids in lithocarpus polysachyus rehd leaves by three-wavelength spectrophotometry.ResultsEquation of linear regression is A=0.038 4C+0.001 3; measuration wavelength is λ1=460 nm, λ2=420 nm, λ3=380 nm，proportional band is 500~3 000 μg/ml，the recovery is 96.6%~106.2% and the coefficient of variation is 0.43%.ConclusionAccuracy and precision of this method are turn up trumps and the operation is simple.
Key words：Flavonoids; Lithocarpus polysachyus rehd; Three-wavelength spectrophotometry
黄酮类化合物是自然界中很重要的一大类天然有机化合物，有关它的提取、分离、分析和药理方面的研究报道很多。对于黄酮类化合物的相互分离以及单一黄酮成分的定量分析常用的有荧光光度法［1］、高效液相色谱法和光谱法［2］，而对于评价和监测天然产物中的黄酮含量往往采用分光光度法［3,4］，一般常用的分光光度法存在一定缺陷［5］，如果加入铝盐会使黄酮类化合物与铝离子形成稳定的配合物，而且吸收带会明显产生红移，同时吸光度也大大增加，但由于干扰成分使其吸收峰不对称给定量分析造成一定的影响。本文在加入铝盐的同时采用三波长-分光光度法测定多穗柯叶中黄酮的含量，有效地消除了吸收峰不对称给定量分析造成的影响，并校正了基于干扰组分的吸收光谱具有可能是散射造成的背景产生的基线倾斜。黄酮的浓度在500～3 000 g/ml范围内分别在波长为λ1=460 nm，λ2=420 nm，λ3=380nm处测吸光度时，则A与浓度C之间呈良好的线性关系，可按标准曲线法进行定量分析。本法的回收率为96.6%～106.2%，变异系数小于0.43%。方法的准确度与精密度均令人满意，而且操作简便易行。
1 方法原理
在黄酮类化合物的紫外光谱吸收中主要吸收带是由300～400 nm之间的吸收带和240～280 nm之间的吸收带组成。因为多穗柯叶中含有棕色素、茶多酚等化合物在带Ⅰ和带Ⅱ范围内均有一定程度的吸收会对黄酮的测定产生干扰。加入铝盐使黄酮类化合物与铝离子形成稳定的配合物，其反应过程如图1所示 。
由此造成吸收带Ⅰ明显产生红移，同时吸光度也大大增加。因此选择铝配合物显色体系来测定多穗柯叶中总黄酮的含量。但由于干扰成分使吸收峰不对称给定量分析造成一定的影响，本文采用三波长-分光光度法测定多穗柯叶中黄酮的含量。三波长-分光光度法的基本原理如图2所示。
在吸收光谱曲线上用做图法适当地选择三个波长 1、 2、 3测定其吸光度A1、A2、A3。由图2可知：
由式可知，A值与待测组分的浓度成正比，可以用于对待测组分的测定。从图1又知，如果在所选择的三个波长处，若其相应的吸收光谱曲线上的三点在一条直线上，则测得的 A值为零。当干扰成分产生吸收光谱为一条直线时，则按上述方法选择三个测定波长，得到的 A值与干扰成分的浓度无关。因此三波长-分光光度法有效地消除了干扰组分或吸收峰不对称给定量分析造成的影响，提高了定量分析的准确度。
2 实验部分
2.1 仪器与实验材料753B1紫外可见分光光度计(日本岛津)；ZFQ 85A型旋转蒸发器：上海医械专机厂；黄酮对照品：国药集团化学试剂有限公司；多穗柯叶样品：采自江西省黎川县武夷山岩泉自然保护区；1%的三氯化铝溶液：称取AlCl3・6H2O 1.756 7 g，加水溶解并稀释至100 ml。黄酮对照储备液：称取0.200 0 g置于100 m l 的容量瓶中，加水使其溶解稀释至刻度摇匀备用。其它试剂均为分析纯。
2.2 吸收曲线的绘制及三波长的确定准确吸取黄酮对照储备液1ml，注入10 ml容量瓶中，加1%的三氯化铝溶液，充分混合至刻度，用1 cm的比色皿在波长200～700 nm 范围内扫描绘制出其吸收曲线见图3。
用作图法确定出三个测定波长分别为λ1=460 nm，λ2=420nm，λ3=380 nm，在测定波长处，分别测定用1%的三氯化铝溶液定容过的黄酮溶液的吸光度值，给出ΔA，值并计算出相应的浓度值。
3 结果与讨论
3.1 标准曲线的绘制分别取0.25，0.50，0.75，1.00，1.25，1.5 ml 的黄酮对照储备液，注入10 ml容量瓶中，加入1%的三氯化铝溶液，充分混合至刻度，在波长λ1=460 nm，λ2=420 nm，λ3=380 nm分别测定其吸光度值，并且给出A值。结果见表1。表1 A值与黄酮浓度的关系标样浓度（略）
求得A与浓度关系的回归方程为：A=0.038 4C＋0.001 3。根据A与浓度的关系可绘制出线性很好的标准曲线，求得相关系数r=0.999 5，经查表得临界相关系数r(99%，n 2)=0.917 0，r>r(99%，n 2)。说明黄酮的浓度在500～3 000 μg/ml范围内，分别在波长为λ1=460 nm，λ2=420 nm，λ3=380 nm处测吸光度时，则ΔA与浓度C之间呈良好的线性关系，可按标准曲线法进行定量分析。
3.2 稳定性实验用与绘制吸收曲线配制相同的方法配制的样品进行稳定性实验，结果表明：样品放置6 h以上，测得其吸光度值不变。
3.3 回收率实验及方法精密度根据前面确定的测试条件，按上述实验方法制备6个不同浓度的样品，按标准加入标准物，在测定波长下测定A，求得其平均回收率标准偏差及变异系数。结果见表2。表2 回收率实验及方法精密度（略）
由表2 可以看出本法的回收率为96.6%～106.2%，变异系数小于0.43%。方法的准确度与精密度均较高。因此三波长-分光光度法为测定多穗柯叶中黄酮含量提供了更准确更可行的方法。
3.4 样品分析取不同采收期多穗柯叶按上述实验方法制备样品溶液,按操作条件在测定波长处测其吸光度分析结果列于表3。表3 多穗柯叶中黄酮的分析结果（略）
由表3可以看出三波长－分光光度法方法准确度较高，对天然产物多穗柯叶中总黄酮含量准确度较高，而且操作简便易行，是一种切实可行的方法。
参考文献：
［1］牟 兰，曾 唏，王海燕.荧光光度法测定蜂胶中黄酮［J］.光谱实验室，2001，18（2）：252.
［2］李梅青，盛 旋，邵学广.反相高效液相色谱法用于葛根黄酮提取物的分离与主要活性成分的测定［J］.分析化学，2003，31(2)：178.
［3］刘林吉，孙曾培，分光光度法测定苦荞麦疗效粉中芦丁的含量［J］.药物分析杂志，1991，11（1）：49.
［4］陈 彦，林晓艳，杨志荣.箭竹叶黄酮类物质提取条件的优化［J］.食品科学，2003，24(1):80.
［5］丁明玉，赵纪萍，李擎阳.贯叶金丝桃提取物中总黄酮的测定方法［J］.分析实验室，2001，20(6)：45.
［6］Hui R H，Hou D Y，Hui Y。L.Quantitave determinationof beraxinate hydrochloride by three wavelength spectrophotomatry［J］.Chemical research in Chinese universities，1994，10(4)：297.
(浙江省丽水市丽水学院，浙江 丽水 323000)
作者简介：肖坤福(1978 )，男(汉族)，湖南常德人，现任丽水学院教师，硕士学位，主要从事天然产物研究工作.