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       【关键词】  红松松子壳；,,酸性多糖；,,提取条件
       摘要：目的实验优选确定松子壳酸性多糖提取最佳条件。方法采用热水浸提法，选择浸提温度、时间、固液比和浸提次数作为单因素进行实验，再通过L9（34）正交实验确定最佳条件。结果松子壳酸性多糖提取最佳条件为浸提温度80℃，时间2 h，固液比为1∶3.5，反复浸提2次。结论该工艺稳定性好，酸性多糖率高。
       关键词：红松松子壳；  酸性多糖；  提取条件
       Optimum Extraction Condition For Acid Polysaccharide From Pine Seed Shell
       ZHANG Dawei, ZHANG Yongliang, KUN Daolieti, LIU Songcai, REN Xiaohui
       (1.College of Animal Husbandry and Veterinany, Jilin University, Changchun 130062, China; 2.I Li Normal College, I Li 835000, China; 3.College of Animal Science and Technology, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 4.College of Aquaculture, Hebei
　　Agricultural University, Hebei Qinhuangdao 066003, China)
Abstract：ObjectiveStudy the optimum extraction condition for acid polysaccharide from pine seed shells.MethodsThe effects of four factors such as the temperature of extraction, the time of extraction, the proportion of water volume, the number of extraction on the extraction of the hot water were investigated. With the orthogonal design of L9(34).ResultsThe optimum conditions of extraction were obtained as follows: Temperature was 80℃, 2 hours evevy time, ratio of solid-liquid 1∶3.5, extraction twice.ConclusionThis process was stable and acid polysaccharide content was high.
       Key words：Pine seed shell;  Acid polysaccharide;  Extraction conditions
   
　　红松松子壳中含有一种酸性多糖，民间很早以前就流传用松子壳煮水治疗胃癌，现代研究也已证明该多糖具有较强的抗肿瘤、抗菌和抗病毒作用［1］，它能明显抑制小鼠S180实体瘤的增殖，降低鼠伤寒杆菌感染小鼠的死亡率，在体外培养的人羊膜细胞（FL）营养液中，加入松子壳酸性多糖后，可保护FL细胞对腺病毒3型（adv3）、腺病毒7型（adv7）、水泡性口炎病毒（vsv）、柯萨奇病毒B4型（CB4）的感染，具有明显作用，特别是对VSV和CB4感染的保护作用更佳。并且，该多糖在体外对HIV(HTLVⅢ)感染MT-4Cells具有病理抑制作用，对猫免疫缺陷病毒（FIV）感染也具有一定的保护作用［2］。同时，该多糖细胞毒性极低，原料来源广泛，具有很好的生物活性和临床应用前景。但有关该类多糖提取条件研究尚未见报道，本文以提取物中多糖含量为指标用苯酚-硫酸法检测，研究了多糖提取过程中浸提时间、温度、固液比、浸提次数等因素对多糖含量的影响，确定了红松松子壳酸性多糖的最佳提取条件。
       1  材料与方法
       1.1  原料长白山产红松松子壳（已粉碎）。
       1.2  设备与试剂电热恒温水浴锅，725P紫外可见分光光度计，FA/JA电子天平，DGG9070A型电热恒温鼓风干燥箱、LD52A低速离心机，SKBⅢ循环水式多用真空泵；无水乙醇、乙醚、浓硫酸、苯酚均为国产分析纯。
　
　　5%苯酚溶液的制备：称取苯酚100 g，铝粉0.1 g，碳酸氢钠0.05 g混匀沙浴加热，收集180~182℃馏分，称取10 g，加水190   g，置棕色瓶中冷藏遮光备用。
       1.3  松子壳酸性多糖单因素提取条件研究原料经简单水洗，70℃烘干，用乙醇∶乙醚（1∶1）混合溶剂浸泡过夜，60℃水浴回流2 h，烘干备用。采用热水浸提法，提取松子壳酸性多糖，研究浸提时间、温度、固液比和提取次数等单因素对多糖含量的影响。
       1.3.1  提取时间选择实验在选定固液比为1∶3，浸提温度为80℃不变的条件，浸提1次，比较不同浸提时间（1，2，3，4，5，6 h）对提取物中多糖含量的影响，以选择最佳提取时间。
       1.3.2  提取温度选择实验固液比为1∶3，提取时间由上一实验确定，分别在70，80，90，100℃的条件下浸提1次，测定多糖含量，确定最佳提取温度。
       1.3.3  固液比（m/v）选择实验在前面实验确定的提取时间和温度下选择固液比为1∶2，1∶3，1∶4，1∶5，1∶6各浸提1次，测定多糖含量，确定最佳固液比。
       1.3.4  浸提次数选择实验在提取时间、温度和固液比均确定条件下，分别浸提1，2，3 次，比较多糖含量，选择最佳提取次数。
       1.4  松子壳酸性多糖正交实验根据单因素实验确定的条件范围，通过L9 ( 34 ) 正交实验得出最佳提取条件。
       1.5  多糖含量的测定
       1.5.1  标准曲线的制作标准葡萄糖溶液的制备：精确称取105℃，干燥恒重的葡萄糖5.0 mg溶解在100 ml容量瓶中制成浓度为50 μg/ml的标准葡萄糖溶液。分别吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1，1.2，1.4 ml标准葡萄糖溶液放入10 ml具塞试管中，用蒸馏水补足至2 ml，分别加入1 ml 5%苯酚溶液，7 ml浓硫酸，充分混匀后，迅速浸入沸水浴中加热15 min，取出冷却至室温，在490 nm处，测其吸光度值，以光密度（A）为纵坐标，多糖浓度(C)为横坐标，得标准曲线，算出回归方程。由测定结果算出回归方程为：C(μg/ml) = 81.267 A - 4.957，r = 0.998
       1.5.2  样品多糖含量测定取经干燥恒重的松子壳提取物2.5 mg溶于50 ml容量瓶中，吸取样品液2 ml放入10 ml具塞试管中，余下同标准曲线操作，将所测光密度值代入回归方程，即可算出样品中多糖的含量，计算公式如下：
提取物中多糖含量（％）=（样品中多糖浓度×稀释倍数/称量样品干重）×100％
       1.6  稳定性实验取4份多糖样品在3 h内，每30 min测1次光密度值。
       1.7  回收率实验采用标准加样回收法，既吸取多糖样品溶液1 ml，分别加入标准葡萄糖溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1 ml放入10 ml具塞试管中，余下同标准曲线操作，分别测其光密度值，根据葡萄糖的检出量，计算其回收率。
       　　2  结果与分析
       2.1  单因素选择实验结果及分析
       2.1.1  浸提时间实验结果与分析不同浸提时间对松子壳提取物中多糖含量的影响见表1，由数据分析，选择浸提2 h为宜。表1  不同浸提时间提取物中多糖含量浸提（略）
       2.1.2  浸提温度实验结果与分析见表2。由数据分析可知，选择浸提温度为80℃。表2  不同浸提温度提取物中多糖含量浸提温度（略）
       2.1.3  浸提固液比结果与分析见表3。由数据分析可知，选择浸提固液比为1∶3。表3  不同浸提固液比提取物中多糖含量浸提固液比 （略）
       2.1.4  浸提次数结果与分析见表4。由数据分析可知，选择浸提次数为3次。表4  不同浸提次数提取物中多糖含量（略）
       2.2  正交实验结果与分析通过以上单因素实验结果，确定因素水平范围(表5)，进行正交实验。表5  正交实验L9（略）
       将实验得到的数据（表6）用直观分析法和SPSS10.0软件［3，4］的正交设计方差分析法，分别进行统计学处理可知，红松松子壳酸性多糖提取最佳条件为W2 T2 S/L3 N2，即温度为80℃，提取时间为2 h，固液比为1∶3.5，提取次数为2次。从极差R可知，4个因素对多糖含量影响顺序为： W > T > N > S/L。从方差分析结果可知（表7），浸提温度、时间和浸提次数对多糖提取具有显著性（P<0.01）影响。固液比较其它3个因素相比影响最小。表6  正交实验L9(34)（略）表7  方差分析结果（略）  
       2.3  稳定性实验见表8。从表8可以看出，多糖样品含量测定中稳定性较好。表8  稳定性实验结果（略）
       2.4  回收率实验从表9可知，应用苯酚-浓硫酸法测定多糖含量准确性较高。表9  回收率实验结果（略）   
       　3  讨论
       3.1  影响松子壳酸性多糖提取的主要条件为浸提温度、时间、固液比和浸提次数。通过单因素梯度实验和正交实验的结果分析，浸提温度、时间和浸提次数对多糖提取具有显著性影响，固液比对多糖提取无显著性影响，四个因素对多糖含量影响顺序为： W > T > N > S/L。
       3.2  实验结果分析可知，松子壳酸性多糖提取的最佳条件为W2 T2 S/L3 N2，即温度为80℃，提取时间为2 h，固液比为1∶3.5，提取次数为2次。为验证上述结果的准确性，在最佳条件下重复实验4次，得提取物中多糖平均含量为46.92%，高于正交表中的全部实验结果。
       参考文献：
       ［1］侯芳玉，孙延波，盛学成，等. 松子壳酸性多糖生物学作用的研究［J］.中草药，1995，26（4）：193.
       ［2］Masatoshi Nakano,Yoshiko Itoh etc. Anti-HIV activity of alkaline extract from pine seed shells (Pinus koraiensis)［J］. Asia Pacific J Clin Nutr ，1998，7(1)：84.
       ［3］陈平雁，黄浙明.SPSS10.0 统计软件应用教程，第1版［M］.北京：人民军医出版社，2002：80.
       ［4］李春喜，王文林.生物统计学，第1版［M］.北京：科学出版社，1997：103.
       1.吉林大学农学部畜牧兽医学院，吉林 长春  130062 ； 
       2.新疆伊犁师范学院，新疆 伊犁  835000；
       3.华南农业大学动物科技学院，广东 广州  510642； 
       4.河北农业大学水产学院，河北 秦皇岛  066003
       作者简介：张大伟(1975)，男(汉族)，吉林长春人，现任吉林大学农学部畜牧兽医学院讲师，硕士学位，主要从事生物化学与分子生物学研究工作.
       通讯作者简介：张永亮(1966)，男(汉族)，吉林长春人，现任吉林大学农学部畜牧兽医学院教授，博士学位，主要从事生物化学与分子生物学研究工作.