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       【关键词】  峨眉野生黄连；,,紫外分光光度法；,,高效液相色谱；,,组织培养
       摘要：目的确定峨眉野连不同器官的总生物碱和小檗碱含量。方法采用紫外分光光度法测定总生物碱含量，高效液相色谱方法测定盐酸小檗碱含量。结果峨眉野连根茎、须根、叶片和叶柄中，均含有生物碱和小檗碱。结论 野连地上器官含有较高的总生物碱和小檗碱，对濒危植物的组织培养及保护提供理论指导。
       关键词：峨眉野生黄连；  紫外分光光度法；  高效液相色谱；  组织培养
       Determination of Total Alkaloid and Berberine Contents in Different Organs from Coptis omeiensis
       ZHOU Jiayu， LIAO Hai， PENG Shuming， CHEN Fang
       (College of Pharmacy, Southwest Jiaotong University, Emei 614202, China; College of Life Science, Sichuan University, Chengdu 610064, China)
       Abstract：ObjectiveTo determine the total alkaloid and berberine contents in rhizome, fibre, lamina and petiole organs from Coptis omeiensis. MethodsThe total alkaloid and berberine contents were determined by UV and HPLC methods respectively. ResultsRhizome, fibre, lamina and petiole organs obtain alkaloid and berberine contents. ConclusionThe comparatively high contents in total alkaloid and berberine in the overground organs of Coptis omeiensis may provide guidance for tissue culture and resource protection.
       Key words：Coptis omeiensis;    UV;    HPLC;    Tissue culture
   
　　黄连为重要的中药材，味苦性寒，具有清热燥湿、泻火解毒之功效。小檗碱为其主要有效成分。与不同品种和产地黄连比较，峨眉野连Coptis omeiensis  C. Y. Cheng的总生物碱和小檗碱含量较高，药性位居上品［1~3］。由于峨眉野连生态环境较为特殊，加之过度的采挖，致使尚未解决家种栽培问题的野连种群数量急剧减少，已处于濒临灭绝的边缘［4，5］。因此笔者认为开展组织培养和人工培育等技术对峨眉野连进行保护已迫在眉睫。测定黄连不同器官的生物碱含量，对组织培养时有选择地诱导根、茎、叶等器官具有指导意义。本实验利用紫外分光光度法和高效液相色谱（HPLC）方法对峨眉野连的根茎、叶片、须根和叶柄的总生物碱和小檗碱含量进行了分析。结果报道如下。
       　　1  仪器与材料
       Waters515型高效液相色谱系统：Waters2487检测器，WDL95色谱工作站；FA1004电子天平（上海天平）；Millipore超纯水制备器和0.45 μm滤膜；SB2200超声波；TU1800紫外可见分光光度（北京普析）；峨眉野生黄连Coptis omeiensisC. Y. Cheng采集于峨眉山，采期为200410中旬~11月上旬，以根茎上节结数推算单株年龄；盐酸小檗碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号0732200005）；乙腈为色谱纯；其余试剂均为国产分析纯。
       　　2  方法与结果
       2.1  总生物碱的含量测定参照文献［1］，采用紫外分光光度法测定。
       2.1.1  标准曲线制备精取不同量盐酸小檗碱标准液（1 mg/ml），加甲醇盐酸（100∶1）稀释至刻度。以甲醇盐酸（100∶1）液为空白对照，于345 nm处测定光吸收值。以光吸收值Y对待测定小檗碱量X（μg）进行线性回归，其回归方程为：Y＝0.062 4X+0.091，相关系数r＝0.999 3。
       2.1.2   总生物碱含量测定精取样液适量，加甲醇盐酸（100∶1）稀释至刻度。以甲醇盐酸（100∶1）液为空白对照，于345 nm处测定光吸收值。计算出相应的总生物碱含量。结果见表1。
       表1  峨眉黄连营养器官总生物碱和盐酸小檗碱含量(略)
       B为小檗碱，T为总碱
       2.2  盐酸小檗碱含量测定
       2.2.1  色谱条件色谱柱：CBL C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈50 mM磷酸二氢钾（50∶50），磷酸调流动相pH至4.7，内含25mM十二烷基硫酸钠（SDS）；流速：1.0 ml/min；检测波长345 nm；柱温：35℃。以盐酸小檗碱色谱峰计算，保留时间为22.10 min，理论塔板数不低于3 000。
       2.2.2  标准曲线精密称取盐酸小檗碱5 mg，置于5 ml容量瓶中，加甲醇盐酸（100∶1）溶解至刻度，配制成每毫升含1 mg的盐酸小檗碱对照品贮备液，并用甲醇盐酸（100∶1）稀释成不同浓度的系列对照品溶液。用微量注射器吸取10 μl不同浓度的对照品溶液，进行液相色谱分析，测定峰面积值，并以峰面积值A对进样量X（μg）进行线性回归，结果小檗碱的直线回归方程为A=106 889＋659 877X，r＝0.999 1。结果表明，盐酸小檗碱在0.25~2.5 μg范围内线性关系良好。
       2.2.3  供试品溶液的制备精密称取同株峨眉野连根茎、叶片、须根和叶柄细粉（样品加入液氮，研磨），置入50 ml磨口的锥形瓶中，加入甲醇-盐酸20 ml，50℃水浴提取120 min，超声波处理60 min，冷却后，过滤，转移到25 ml容量瓶中，加甲醇-盐酸稀释至刻度，备用。高效液相色谱见图1。
       2.2.4  精密度实验精密吸取0.031 25 mg/ml的盐酸小檗碱对照品溶液10 μl注入液相色谱仪，测定峰面积，重复5次，小檗碱峰面积的RSD＝1.30%。
       2.2.5  稳定性实验取0.05 mg/ml的盐酸小檗碱对照品溶液，分别于0，1，2，4 h和6 h注入液相色谱仪，测定盐酸小檗碱峰面积的RSD＝1.43%。
       2.2.6  加样回收率实验精密称取已知含量的野连根茎细粉0.1 g，精密加入盐酸小檗碱0.25 mg。按3.3方法制备，并按上述色谱条件测定，计算回收率。测得盐酸小檗碱的平均回收率为97.3%，RSD＝2.1%。
       a甲醇盐酸（100∶1）    b盐酸小檗碱对照品　c根茎样品（零公里）
       图1  高效液相色谱图(略)
       　　3  讨论
       由于本实验以鲜品为材料，因此实验结果低于文献报道的峨眉野连药材总生物碱（7%~9%）和盐酸小檗碱（5%~8%）含量［1~3］，但是鲜品材料中的数据，对植物组织培养具有更重要的指导意义。在低龄野连（3~5年）中，呈现总碱含量根茎＞叶片＞须根＞叶柄的趋势，小檗碱含量根茎＞叶片＞叶柄＞须根的趋势。在年龄较长的野连（8~9年）中，呈现总碱含量根茎＞须根＞叶片＞叶柄的趋势，小檗碱含量根茎＞须根＞叶片≈叶柄的趋势。这种变化可能与野连植株的年龄和生长环境等因素有关。总体来看，峨眉野连的常用入药部位（须根、叶片和叶柄）中总碱和小檗碱含量水平较高，这对野连的保护及合理利用开辟了一条新的思路：入药部位的扩大，使药用植物资源得以最大限度的利用，能够缓解对野生资源的压力。并且，我们在组织培养过程中发现，诱导野连的根茎较难，特别是难以达到自然生长状态下根茎的长度，而诱导芽相对较容易。由于野连采集较为困难，未能收集到年龄更长的植株（＞10年），未能就生物碱变化和积累趋势进行进一步的探讨。本文中采用的色谱条件，盐酸小檗碱与其它组分分离度好，重现性好，精密度好，回收率高，本实验结果方法可作为黄连组织培养材料中小檗碱的测定。
       　参考文献：
       ［1］  赵庆国，吴素体，王  颖，等. 不同品种和产地黄连的总生物碱含量测定［J］. 时珍国医国药，2001，12(11): 974.
       ［2］  庄  平，黄明远. 峨眉山野生黄连个体生物量与生物碱含量研究［J］. 中草药， 1994，25(8): 425.
       ［3］  晁若冰，张  浩，庄燕黎，等. 高效液相色谱法测定黄连药材中小檗碱型生物碱的含量［J］.药物分析杂志，2003，23(5): 354.
       ［4］  杨世林，张  昭，张本刚，等. 珍稀濒危药用植物的保护现状及保护对策［J］. 中草药，2000，31(6): 401.
       ［5］  宋良科，张富贵. 峨眉山濒危药用植物资源的初步研究［J］.中国野生植物资源，2003，22(3): 21.
       基金项目：西南交通大学峨眉校区科技发展基金资助项目（No.3011012）
       (西南交通大学药学院，四川 峨眉  614202；  四川大学生命科学学院，四川 成都  610064)