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       【关键词】  复方大黄颗粒；,,,大黄素；,,,大黄酚；,,,高效液相色谱法
       摘要：目的建立反相高效液相色谱(RPHPLC)法测定复方大黄颗粒中大黄素和大黄酚的含量。方法Alltima C18色谱柱（5 μm,150 mm×4.6 mm）；柱温：30℃；流动相：甲醇0.1%磷酸（87∶13）；流速：1 ml/min；检测波长：254 nm。结果大黄素的线性范围为0.096~0.576 μg（r=0.999 9），平均回收率为99.29%，RSD为0.63%；大黄酚的线性范围为0.078 4~0.470 4 μg（r=0.999 8），平均回收率为100.08%，RSD为1.52%。结论该方法灵敏度高、操作简便、重现性好、效率高。可作为样品的检测方法。
       关键词：复方大黄颗粒；   大黄素；   大黄酚；   高效液相色谱法
       Determination of Emodin and Chrysoplhanol in Compound Rhubard Granula by RPHPLC
       LIANG Hengxing, YUE Ling, CAI Xujiao
       (Chengdu University of TCM, Chengdu  611730,China)
       Abstract:ObjectiveTo develop an RPHPLC method for determination of emodin and chrysophanol in Compound Rhubard Granula.MethodsThe samples were determined by RPHPLC with a Alltima C18column(5 μm,150 mm×4.6 mm) and UV detector at 254 nm.The mobile phase was methonal∶0.1%H3PO4(87∶13)at a flow rate of 1.0 ml/min.The column temperature was 30℃.ResultsThe calibration curve of emodin was linear over the ranges of 0.096μg~0.576 μg (r=0.999 9),average recovery was 99.29,RSD was 0.63%;The calibration curve of chrysophanol was linear over the ranges of 0.078 4~0.470 4 μg (r=0.999 8),average recovery was 100.08%,RSDwas 1.52%.ConclusionThis method is simple,reliable,efficient,and it provides a reliable method for determination of emodin and chrysophanol in Compound Rhubard Granula.
       Key words:Compound Rhubard Granula;   Emodin;   Chrysophanol;   HPLC
   
　　复方大黄颗粒由大黄、牡丹皮、丹参、延胡索等多味中药组成，具有清热凉血、活血化淤、消肿止痛等作用。大黄能逐瘀通经、凉血解毒、清热泻火，为方中君药，现代药理研究证明其主要有效成分大黄素、大黄酚等成分具有抗病原体、抗炎、免疫调节、改善微循环等药理作用［1］。为了有效地控制药品质量，本实验建立了用反相高效液相法测定复方大黄颗粒中大黄素和大黄酚含量的方法。现将结果报道如下。
       　　1  仪器与试剂
       岛津高效液相色谱仪（SPD10A VP UVVIS DETECTOR，LC10AT VP LIQUID CHROMATOGRAPH，CTO10AS VP COLUMN OVEN，渐大智达N2000色谱工作站），Sartorious CP225D型电子天平（万分之一，德国SatoriUs公司）。复方大黄颗粒（本实验室自制，批号20041201，20041202，20041203）；大黄素对照品购自中国药品生物制品检定所（供含量测定用，批号：110756200110）；大黄酚对照品购自中国药品生物制品检定所（供含量测定用，批号：110796200306）。甲醇为色谱纯；水为重蒸水；其它试剂均为分析纯。
       　　2  方法与结果
       2.1  色谱条件色谱柱：Alltima C18色谱柱（5 μm,150 mm×4.6 mm）；柱温：30℃；流动相：甲醇0.1%磷酸（87∶13）；流速：1 ml/min；检测波长：254 nm；灵敏度0.1 AFUS。
       2.2  对照品溶液的制备精密称取大黄素对照品12.0 mg，置25 mg容量瓶中，加甲醇使溶解，并定容至刻度，摇匀，得对照品贮备液。再精密吸取大黄素对照品贮备液1 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，作为大黄素对照品溶液（浓度为：0.048 mg/ml）；另取大黄酚对照品9.8 mg，置25mg容量瓶中，加甲醇使溶解，并定容至刻度，摇匀，得对照品贮备液。再精密吸取大黄酚对照品贮备液1 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，作为大黄酚对照品溶液（浓度为：0.039 2 mg/ml）。
       2.3  供试品溶液的制备取同批号复方大黄颗粒5袋，混匀后，碾细，取约4 g，精密称定，置10 ml锥形瓶中，精密加入甲醇50 ml，称定重量，加热回流30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液5 ml，收干甲醇，加2.5 mol/L硫酸溶液10 ml，超声处理5 min，再加氯仿10 ml，加热回流1 h，冷却，置分液漏斗中，用少量氯仿洗 涤容器，并入分液漏斗中，分取氯仿层，酸液用氯仿提取3次，约10 ml/次。合并氯仿液，回收氯仿，残渣用甲醇溶解，转移至25 ml量瓶中，定容，即得。
       2.4  阴性对照溶液的制备取阴性样品（不含大黄）4 g，精密称定，按“供试品溶液的制备”项下方法依法制备，即得阴性对照溶液。
       2.5  干扰实验照上述色谱条件，吸取上述4种溶液各10 μl，分别注入液相色谱仪。供试品色谱在与对照品色谱相应的位置上，有一相同的色谱峰，而阴性在此保留时间无干扰（见图1~4）（大黄素保留时间为12.5 min，大黄酚保留时间为9.4 min）。
       图1  大黄素对照品色谱图（略）
       图2  大黄酚对照品色谱图（略）
       图3  复方大黄颗粒色谱图（略）
       图4  缺大黄阴性色谱图（略）
       2.6  线性关系的考察分别精密吸取上述两种对照品溶液各2，4，6，8，10，12 μl注入液相色谱仪，测定（n=2），记录色谱峰面积的积分值，以峰面积值（A）对进样量（C）进行回归，得回归方程为：大黄素：A=41 856C-17 151（r=0.999 9）；大黄酚：A=120 440C-104 717（r=0.999 8）。试验结果表明，大黄素对照品进样量在0.096~0.576 μg范围内呈良好的线性关系；大黄酚对照品进样量在0.0784~0.4704 μg范围内呈良好的线性关系。
       2.7  精密度实验取同一对照品溶液重复进样5次，记录大黄素和大黄酚的峰面积值，计算RSD分别为：大黄素0.53%，大黄酚0.47%，表明本法精密度良好。
       2.8  稳定性实验取同一样品供试液分别于1，2，4，6，8 h进样，记录大黄素和大黄酚的峰面积值，计算RSD分别为：大黄素0.73%，大黄酚0.86%，表明样品供试液在8 h内稳定性良好。
       2.9  重复性实验按“供试品溶液制备”项下操作，重复制备5份样品供试液，进样测定，记录大黄素和大黄酚的峰面积值，计算得大黄素平均含量为0.308 mg/ml，RSD为0.81%；大黄酚的平均含量为0.231 mg/ml，RSD为0.89%，方法重现性良好。
       2.10  加样回收实验精密称取已测知含量的样品18份，每份约2 g，分别加入大黄素、大黄酚对照品贮备液适量，按供试品溶液制备项下方法测定，由公式：加样回收率（%）=〔（测得理-样品原有量）/加入量〕×100%，计算回收率。结果见表1。
       表1  加样回收率测定结果（略）
       2.11  样品测定分别取不同批号的复方大黄颗粒4 g，精密称定，按“供试品溶液液的制备”项下方法依法制备供试品溶液，按上述色谱条件依法测定。结果见表2。
     
　　表2  复方大黄颗粒中大黄素、大黄酚含量测定（略）
       　　3  讨论
       3.1  本方是由多味中药组成的复方制剂，直接测定由于干扰较大，达不到理想的分离效果，需要净化。经反复实验，采用本文的方法可使样品中大黄素峰、大黄酚峰达到较好分离，用于本制剂中大黄成分的含量测定，能控制本制剂质量。
       3.2  测定波长的选择的方法为将大黄素和大黄酚对照品溶液在200~600 nm波长范围扫描，大黄酚在210，254 nm处各有一个较强的吸收峰，大黄素在254 nm处也有一个较强的吸收峰，故选择254 nm作为检测波长。
       3.3  实验中对流动相甲醇水、甲醇磷酸系统进行比较，结果表明加入一定量的酸能较好地改善峰形；对磷酸的用量进行考察。结果表明，以0.1%的磷酸效果最好。
       参考文献：
       ［1］  李淑娟,董晓华,武海霞,等.大黄及其有效成分药理作用研究进展［J］.医学综述,2005,11(1):76.
       (成都中医药大学，四川 成都  611730)