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       【关键词】  中草药提取液；,,灵芝；,,三萜
       摘要：目的研究5种中草药水提取液对灵芝液体培养的菌丝体生物量和三萜含量的影响 。方法在基本培养基中分别添加了终浓度为5%的中草药水提取液，液体培养4 d后，测定各灵芝菌丝的生物量和三萜含量。结果与结论  中草药水提取液对菌丝体生物量均有促进作用，其中银杏促进作用最明显，增幅达27.7%，而生地最弱，增幅为4.6%；而生地水提取液对灵芝菌丝体的三萜含量有抑制作用，其余4种有促进作用，其中银杏增幅最高为17.1%。
       关键词：中草药提取液；  灵芝；  三萜
       Influence of Water Extracts of Five Chinese Herbal Medicines on the Content of Triterpenoids of Ganoderma lucidum
       YU  Zhijian， CHEN Chuanhong， GAO Lingfei, BAO Shuiming, LI Rongtong
       (Department of Biology, East China College of Science and Technology, Fuzhou, Jiangxi 344000, China)
       Abstract：ObjectiveTo observe the influence of water extracts of five Chinese herbal medicines on the contents of the biomass and the triterpenoids of mycelium of Ganoderma lucidum by submerged culture. MethodsAdded 5% water extracts, to the basement various biomass and triterpenoids of mycelium of Ganoderma lucidum were determined after submerged culture 4 d. Results and ConclusionWater extracts of all the five Chinese herbal medicines improved the production of the biomass; the highest increasing scope of Ginkgo biloba was 27.7%, whde Rehmannia glutinaosa was 4.6%. Water extracts of all the five Chinese herbal medicines can also increase the content of triterpenoids of mycelium except Rehmannia glutinosa, the highest increasing scope of Ginkgo biloba was 17.1%.
       Key words：extracts of Chinese herbal medicine;  Ganoderma lucidum;  Triterpenoids
   
　　灵芝［Ganoderma lucidum (Curtis:Fr.) Karst］为灵芝属（Ganoderma）真菌，在我国有悠久的药用历史，为一种名贵滋补类中药材［1］，千百年来被中国人视为神奇药草之王。药理研究表明，灵芝对人体免疫系统、神经系统、心血管系统有很好的调节作用，同时具有抗肿瘤、抗衰老作用［2］等较广泛的药理活性。迄今为止，已从灵芝中分离到150余种化合物，可分为多糖类、核苷类、呋喃类、生物碱类、三萜类、油脂类、甾醇类、无机离子、有机锗等10大类［3，4］，三萜类为其主要药用组分之一。灵芝代谢产物可能与中草药的有效成分发生复方、协同作用，如灵芝在添加中草药培养液的环境中可能加速加大灵芝萜类的形成，增加其生物活性［5］。中药的某些成分可能促进灵芝的生长和有效成分的产生，使灵芝的原有作用得到补充或增强，从而具有更强的保健、预防或治疗功能，以便于进一步制作出配伍更佳的［6］新型复合发酵制剂，用于功能性食品的开发等方面。为此，本实验采取在灵芝液体培养基中添加一定量的中草药提取液，以灵芝的三萜类含量为指标，筛选出对灵芝三萜有促进作用的中草药及合适的剂量，为利用灵芝深层发酵活性三萜提供了优良配方，以满足商品化、工业化生产的需要；同时也为进一步进行功能性食品的开发提供了科学依据。
       　　1  材料与方法
       1.1  材料
       1.1.1  菌种韩国灵芝母种购自中科院微生物研究所菌种保藏中心，再用PDA培养基试管斜面在25~27℃恒温条件下，培养7d即可。
       1.1.2  培养基配方（1）液体菌种配方：马铃薯200 g、蔗糖20 g、蛋白胨2 g、MgSO4 2 g、KH2PO4 2 g、加H2O至1 000 ml，用250 ml三角瓶装瓶，每瓶装量为75 ml，用高压灭菌锅121℃灭菌30 min，冷却接种后，置25℃恒温摇床，转速为150 r/min条件下培养4 d即可。（2）液体发酵基础培养基配方：黄豆12.5 g，葡萄糖20 g，中草药5 g，用水定容至1 000 ml，pH自然。
       1.1.3  中药材金银花（Lonicera japonica Thunb.），于5~6月采集正在开花的金银花藤蔓，晒干切段；银杏（Ginkgo biloba L.），于8月采自东华理工学院银杏林；鱼腥草（Houttuynia cordata Thunb.），于5～6月采自抚州市市郊；绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum Thunb.)和生地（Rehmannia glutinosa Libosch）购自抚州市黄庆仁栈药店。
       1.1.4  中草药水提液的制备称取中草药取20 g，加6倍水浸1 h后，用砂锅煎煮15 min，过滤，取滤液。再在药渣中补加适量的水，煎煮10 min，过滤，取滤液。合并滤液，定容至1 000 ml，备用。
       1.1.5  菌丝体获得按液体菌种2 ml量液体接种后，置25℃恒温摇床，转速为150 r/min条件下培养4 d，每个样品设2 个重复。
       1.1.6  菌丝体干重的测定收取的发酵醪液以3 500 r/min离心收集菌丝球，于60℃烘干至恒重，称重，备用。
       1.2  仪器与药品753BI微机紫外可见分光光度计；索氏提取器；香草醛、冰醋酸、高氯酸；DHT电热套；熊果酸购于中国药品生物制品鉴定所。
       　　2  方法与结果
       2.1  样品三萜含量的测定
       2.1.1  标准品液配制精密称取干燥至恒重的熊果酸对照品10 mg，置于100 ml容量瓶中，加95%乙醇溶解并定容至刻度，浓度为0.1 mg/ml。
       2.1.2  显色剂使用条件的选择显色剂使用条件的选择实验方法参考皮文霞等［7~10］，实验得出，5%香草醛冰醋酸最佳用量为0.2 ml，高氯酸用量为0.8 ml时最佳。
       2.1.3  标准曲线的绘制精密吸取熊果酸对照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 ml，按上述优选条件及步骤在548 nm处测定吸收值，以吸收度为纵坐标，熊果酸的微克数做横坐标作标准曲线：y = 0.105 6x - 0.005 9(R2= 0.993 6)。
       2.1.4  样品三萜含量的测定精密称取上述收集到的灵芝菌丝体干燥粗粉各10 g，用醋酸乙酯在索氏提取器中回流4 h，提取液浓缩至干后，置于100 ml容量瓶中，加95%乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，测定吸收值，按回归方程计算含量。
       2.2  5种中草药水提液对灵芝生物量和三萜含量的影响见表1。
       表1  5种中药水提液对灵芝生物量和三萜含量的影响（略）
       　　3  讨论
       三萜类化合物为灵芝主要药用成分之一，国内外已经有很多报道［10~13］，但利用中草药水提取液整合灵芝有效成分还未见报道。本文利用在液体发酵基础中添加5种中草药水提取液，研究了上述5种中草药水提取液对灵芝菌丝体生长量和三萜类化合物含量的影响。低浓度的中草药提取液对菌丝体生物量有促进作用，银杏的促进作用最明显，增幅达27.7％，其次依次为绞股蓝、鱼腥草以及金银花，而生地最弱，增幅为4.6％。并且生地水提取液对菌丝体三萜含量有抑制作用，其余4种中草药水提取液均有促进作用，其中银杏水提取液增幅最高为17.1％，其余依次为金银花、鱼腥草和绞股蓝。
       　　参考文献：
       ［1］  国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2000：147.
       ［2］  曾祥丽，包海鹰.灵芝三萜成分与药理学研究进展［J］.菌物研究，2004，2(1):68.
       ［3］  章灵华，肖培根.近十年灵芝研究的进展［J］.西北药学杂志，1993，8(1):31.
       ［4］  陈若云，干德泉.灵芝三萜化学成分研究进展［J］.药学学报，1990，25(12):940.
       ［5］   武忠伟，郭爱莲，殷  红，等.中草药提取液对冬虫夏草深层培养的影响［J］.食品科学，2005，26(6 ):116.
       ［6］  王兴红，李旗德，曹秋娥. 微生物发酵中药应成为中药研究的新内容［J］.中草药，2001，32(3): 267.
       ［7］  皮文霞，蔡宝昌，郭胜伟，等.分光光度法测定山茱萸制剂中总三萜酸的含量［J］.南京中医药大学学报，2003，19(2):99.
       ［8］  王文祥，顾振纶.比色法测定山楂总三萜酸含量［J］.中国野生植物资源，2001，20(5):47.
       ［9］  帕丽达，堵年生，丛媛媛，等.比色法测定琐琐葡萄中总三萜类成份的含量［J］.华西药学杂志，200217(6):475.
       ［10］  赵明文，王晨光，鲍  鹏，等. 不同灵芝菌丝体中三萜与多糖含量的比较 ［J］.中国食用菌，2003，22 (2): 43.
       ［11］  Xuemei Niu, Minghua Qiu, Zhongrong Li , et al. Two novel 3 , 4 seco trinorlanostane triterpenoids isolated from Ganoderma fornicatum［J］. Tetrahedron Letters, 2004 ,45: 2989 .
       ［12］  Smania EFA, Delle Monache , F Smania A Jr, et al. Antifungal activity of sterols and triterpenes isolated from Ganoderma annulare［J］. Fitoterapia , 2003 , 74 (4) :375.
       ［13］  Kenji Iwatsuki , Toshihiro Akihisa , Harukuni Tokuda , et al. Lucidenic Acids P and Q, Methyl Lucidenate P, and Other Triterpenoidsfrom the Fungus Ganoderma lucidum and Their Inhibitory Effects on Epstein Barr Virus Activation［J］. J. Nat. Prod. 2003 , 66 (12) : 1582.

　　基金项目：东华理工学院硕士启动基金资助项目（No.DHS0428）
       (东华理工学院生物系，江西 抚州  344000）