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       【关键词】  高效液相色谱法；,,克感利咽口服液；,,栀子苷
       摘要：目的建立高效液相色谱 (HPLC)法测定克感利咽口服液中栀子苷的含量。方法采用高效液相色谱法，以 Diamonsil(钻石)C18柱为固定相，甲醇-水(29：71)为流动相，流速1 ml/min，检测波长241 nm，柱温30°C。结果在0.236 4～1.773 μg范围内，栀子苷的量与峰面积积分值呈良好的线性关系，r＝0.999 9，平均回收率98.96％，RSD ＝2.31％。结论所建立的方法能准确、快速地进行定量检测，可用于克感利咽口服液的质量控制。
       关键词：高效液相色谱法；  克感利咽口服液；  栀子苷
       Determination of Geniposide in Kegan Liyan Oral Solution by HPLC
       QIN Chun-mei,HUANG Xiao-dan,FENG Chong,  XIAN Jian-min
       （Guangzhou Wanglaoji Pharmaceutical Company Limited, Guangzhou 510450,China）
       Abstract:ObjectiveTo establish a method for determination of geniposide in Kegan Liyan Oral Solution．MethodsHPLC method was selected to determine the content of geniposide．The chromatographic conditions included Diamonsil C18 column，methanol-water(29:71) as the mobile phase, the detection wavelength at 241nm，flow rate 1.0ml/min and column temperature at 30°C. ResultsThe linear range was 0.236 4～1.773 μg and the average recovery was 98.96%,RSD ＝2.31％．ConclusionThis method is accurate and quick ,and can be used for the quality control of Kegan Liyan Oral Solution.
       Key words:HPLC；  Kegan Liyan Oral Solutio；  Geniposide
   
　　克感利咽口服液是王老吉药业股份有限公司和中国中医研究院广安门医院合作研制的原三类中药新药，临床上主要用于治疗风热外侵，邪热内扰之症引起的呼吸道感染，疗效确切，是我公司的主流产品之一，2004年被批准为中药保护品种。原质量标准采用薄层色谱法测定栀子苷含量，样品采用多次萃取制备供试品溶液，该方法较繁锁，测定方法也较为复杂。根据国家中药保护品种委员会意见和我单位实际情况，确定修改质量标准栀子苷的含量测定方法，采用高效液相色谱法测定栀子苷含量，测定结果表明，该测定方法简便可行，重现性好。栀子苷 (geniposide)是栀子化学成分中一种重要的环烯醚萜类化合物，《中国药典》2005年版Ⅰ部以栀子苷作为栀子的薄层色谱鉴别、高效液相色谱含量测定的对照品［1］。根据文献报道，栀子的含量测定方法有薄层色谱紫外分光光度法［2］，薄层色谱扫描法［3~5］，高效液相色谱法［6~7］ 等。本实验采用高效液相色谱法测定栀子苷含量，分析速度快，灵敏度高，专属性强，应用范围广，重现性与准确性均优于薄层色谱紫外分光光度法、薄层色谱扫描法。
       　　1  仪器与试药
       1.1  仪器 Waters 600高效液相色谱仪（600低压梯度泵、717自动进样器、2996 DAD检测器,柱温箱，）；Empower工作站；Bp211-D型电子天平（十万分之一，德国 Sartorous 公司）。
       1.2   药品与试剂 栀子苷对照品（中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号110749-200309）；甲醇为色谱纯，水为高纯水，其余试剂均为分析纯；克感利咽口服液由广州王老吉药业股份有限公司生产提供；缺栀子阴性制剂自制。
       　　2  方法与结果
       2.1  对照品溶液的制备  精密称取栀子苷对照品5.91 mg，置50 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，制成每毫升中含栀子苷0.118 2 mg的溶液，即得。
       2.2   供试品溶液的制备  精密移取克感利咽口服液（批号030402）2 ml，置25 ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。用0.45 μm滤膜过滤，取续滤液，即得。
       2.3   阴性对照溶液的制备  除去栀子，按照克感利咽口服液的制备方法制备阴性样品，按供试品溶液的制备方法制备成栀子阴性对照溶液。最大吸收波长的确定  经紫外光谱检测，栀子苷在241 nm处有紫外最大吸收，故选择该波长为检测波长。与《中国药典》2005年版Ⅰ部栀子项下的规定一致，光谱图如图1。
       a栀子苷   b克感利咽样品  c栀子药材  d栀子阴性光谱图
       图1  光谱图（略）
       2.4   色谱条件及系统适用性实验    色谱柱：Diamonsil(钻石)C18柱，5 μm ，250 mm×4.6 mm，流动相：甲醇水(29∶71)，流速：1 ml/min，柱温：30℃；检测波长：241 nm。分别取对照品溶液、样品溶液、阴性对照溶液各10 μl注入液相色谱仪，按上述色谱条件记录色谱图，理论塔板数按栀子苷峰面积计算不低于3 000，栀子苷峰与之相邻峰的分离度不低于2.0。栀子苷的保留时间约为14.7 min，栀子苷与供试溶液中其它组分达到基线分离，阴性对照液图谱在栀子苷峰位置无吸收峰，分别见图2。
       2.5    线性关系及标准曲线  精密吸取栀子苷对照品溶液（0.118 2 mg/ml)2，4，6，8，10，15 μl 进样，按上述色谱条件测定，以栀子苷的量（μg）为横坐标，其峰面积吸收度积分值（Area）为纵坐标，绘制标准曲线,计算回归方程为：Y = 1 563 686 X -36 413 相关系数 r=0.999 9，栀子苷的量在0.236 4～1.773 μg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。绘制标准曲线图，结果见图3。
       图2  专属性实验图（略）
       图3  栀子苷标准曲线图（略）
       2.6   方法精密度实验  取同一供试品溶液（批号030402）4 μl，重复进样5次，测定峰面积积分值分别为706504，709353，713770，708032，705146，平均值为708561，RSD为0.47％。
       2.7   稳定性实验 取同一供试品溶液（批号030402），分别于0，2，4，8，10 h各进样4 μl ，测定栀子苷峰面积积分值为705146，708032，704623，712556，696685，平均值为705408，RSD为0.82%，表明样品在10 h内稳定性较好。
       2.8   方法重现性实验取同一批号克感利咽口服液样品（批号030402）5份，精密称定，照供试品溶液的制备方法制备5份供试液，分别注入液相色谱仪，测定栀子苷含量，结果平均含量6.79 mg/支，RSD为1.52%。结果表明，重现性良好。
       2.9   回收率实验精密移取已知栀子苷含量（按6.79 mg/支）的克感利咽口服液样品（批号030402） 1 ml，精密称定，共6份，分别加栀子苷对照品（0.652 mg/ml）0.8 ，0.8 ，1.0 ，1.0，1.2，1.2 ml ，照供试品溶液的制备方法制备供试液，用0.45μm滤膜滤过，精密吸取续滤液10 μl，分别注入液相色谱仪，测定，计算。结果见表1。回收率＝栀子苷测得量－样品中栀子苷的量    栀子苷加入量×100％
       2.10   成品中含量测定及限量规定  按本品质量标准项下克感利咽口服液的含量测定方法，对20批克感利咽口服液样品进行含量测定，结果见表2。
       表1  加样回收试验结果表（略）
  
　　结果表明，该方法加样回收率在95%～105%之间，满足规定要求。
       表2  成品中栀子苷的含量测定结果（略）
       *为每支中含量
  
　　根据上述20批克感利咽口服液样品的数据进行分析，含量基本稳定，这与投料前控制了药材质量有密切关系，在连续积累数据的基础上，为有效控制质量，建议栀子苷含量限度为不少于4.5 mg/支。
       　　3   结论
       采用 HPLC法测定克感利咽口服液中栀子苷的含量，样品前处理方法简单，色谱条件成熟稳定，测定结果重现性好，完全可以替代原质量标准中薄层色谱法测定栀子苷含量。通过以上实验，我公司按中药补充申请要求，申报 SFDA修订质量标准方法，为以后我公司克感利咽口服液产品的检验工作提供方便，同时为该产品的进一步开发提供实验依据。
       　　参考文献：
       ［1］  国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社：173.
       ［2］  许  良,王青虎,特木尔巴根.薄层紫外法测定如达六散中栀子苷含量［J］.时珍国医国药,1999,10(9):662.
       ［3］  方肇年,熊义涛,叶小川,等.薄层扫描法测定石淋止痛剂中栀子苷的含量［J］.中国中医药科技,1997,4(4):227.
       ［4］  梁生旺,张广强,李永军,等.薄层扫描法测定清肝利胆注射液中4种有效成分的含量［J］.药物分析杂志,1995,15(1):24.
       ［5］  郜迎晨.用薄层扫描法测定清热解毒注射液中栀子苷［J］.中国药业,1999,8(9):27.
       ［6］  申玉华,孙银姬,于文静,等.反相高效液相色谱法测定栀子药材及其制剂中栀子苷的含量［J］.中国药品标准,2001,2(3):47.
       ［7］  芦柏震,李心泓,杨江丰.HPLC测定中肝合剂中芍药苷及栀子苷的含量［J］.中国药学杂志,2001,36(1):48.
       （广州王老吉药业股份有限公司，广东 广州  510450）