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       【关键词】  补肾益气颗粒；,,补骨脂素；,,异补骨脂素；,,高效液相色谱法
       摘要：目的建立补肾益气颗粒中补骨脂素和异补骨脂素的含量测定方法。方法Diamonsil C18柱（200 mm×4.6 mm,5 μm）,流动相为甲醇水（55∶45），流速0.85 ml/min，检测波长245 nm。结果补骨脂素的线性范围为0.08～0.8 μg，r=0.999 98(n=6)，平均加样回收率为99.69％，RSD为2.27％;异补骨脂素的线性范围为0.079 6～0.796 μg，r=0.999 98(n=6)，平均加样回收率为100.25％，RSD为2.82％。结论 该法简便，准确，重现性好，可使补骨脂素和异补骨脂素达到基线分离， 可以控制补肾益气颗粒的质量。
       关键词：补肾益气颗粒；  补骨脂素；  异补骨脂素；  高效液相色谱法
       Determination of the Psoralen and Isopsorlen in Bushenyiqi Granules by HPLC
       ZHANG Zhuangli, LIU Li, XU Desheng*
       (Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of TCM, Shanghai 200021,China)
       Abstract：ObjectiveTo establish a method for the determination of psoralen and isopsoralen in Bushenyiqi granules.MethodsThe Diamonsil C18（200 mm×4.6 mm,5 μm）was used.The mobile phase consisted of methanol-water(55:45).The flow rate was 0.85 ml・min-1.The UV detective wavelength was 245 nm.ResultsThe linear range of psoralen was 0.08～0.8 μg, r=0.999 98(n=6) with an average recovery rate of  99.69％(RSD=2.27％),the liner range of isopsoralen was 0.079 6～0.796μg，r=0.999 98 (n=6) with an average recovery rate of 100.25% (RSD=2.82%).  ConclusionThe method can be used to control the quality of Bushenyiqi granules with such advantages as simple,reliable and good reproducibility.
       Key words：Bushenyiqi Granules；  Psoralen；  Isopsoralen；  HPLC
   
　　补肾益气颗粒由补骨脂、黄芪、党参等组成，由汤剂改变剂型而来，具有益气、补肾、健脾的功效。本实验建立了HPLC法检测该颗粒中补骨脂素和异补骨脂素的含量测定方法。
       　　1  器材
       补骨脂素（含量测定用，中国药品生物制品检定所，0739200108）；异补骨脂素（含量测定用，中国药品生物制品检定所，07389907）；甲醇（色谱纯，上海陆都化学试剂厂）；双蒸水(自制)；HP1100高效液相色谱仪（美国惠普公司）。
       　　2  方法与结果
       2.1  色谱条件色谱柱为Diamonsil C18（200 mm×4.6 mm,5 μm）；流动相为甲醇水（55∶45）；流速0.85 ml・min-1；检测波长245 nm。此条件下，补骨脂素和异补骨脂素可达基线分离，分离度大于1.5；理论塔板数大于2 000。色谱图见图1~2。
       2.2  线性关系考察分别取补骨脂素和异补骨脂素10 mg，精密称定，以甲醇溶解并定容于25 ml容量瓶中制成混合对照品溶液（补骨脂素和异补骨脂素浓度分别为0.400，0.398 mg・ml-1），以此为母液配成补骨脂素和异补骨脂素浓度分别为0.008，0.016，0.032，0.048，0.064，0.080，0.007 96，0.015 92，0.031 84，0.047 76，0.063 68，0.079 6 mg・ml-1。分别吸取上述对照品溶液10 μl，按上述色谱条件进行测定。以峰面积积分值为纵坐标Y，对照品含量为横坐标X（μg），绘制标准曲线，计算回归方程：补骨脂素：Y＝10 609X－19.3，r＝0.999 98，线性范围为0.08～0.8 μg，在此范围内线性关系良好；异补骨脂素：Y＝9 793.2X－21.317，r＝0.999 98，线性范围为0.079 6～0.796 μg，在此范围内线性关系良好。
       图1  补骨脂素和异补骨脂素混合对照品色谱图（略）
       图2  样品色谱图（略）
       2.3  供试品溶液的制备取本品适量研匀，称取约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，精密称定，密塞，称定重量，超声处理1h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
       2.4  空白对照实验按本制剂的处方、工艺制成缺补骨脂的阴性制剂，按上述供试品溶液制备方法及测定方法实验，结果表明其他成分对补骨脂素和异补骨脂素的测定无干扰。色谱图见图3。
       图3  空白对照色谱图（略）
       2.5  精密度实验吸取同一混合对照品溶液，连续进样6次，测定峰面积，结果补骨脂素RSD为0.73%，异补骨脂素RSD为0.59％。
       2.6  重复性实验同一批号的样品，平行取样6份，按供试品溶液的制备方法进行制备，进样10 μl，测定，结果补骨脂素平均含量为0.306 0 mg・g-1，RSD为1.40%；异补骨脂素平均含量为0.307  1 mg・g-1，RSD为2.28%。
       2.7  稳定性实验
       2.7.1  对照品精密吸取同一混合对照品溶液10 μl，分别于0，24，48 h进样，测定峰面积，结果补骨脂素RSD为0.62％，异补骨脂素RSD为0.70％，表明混合对照品溶液在48 h内稳定性良好。
       2.7.2  供试品稳定性实验取新鲜配制的供试品溶液，分别于0，1，2，4，6，10，24 h进行测定，结果补骨脂素RSD为2.76%；异补骨脂素RSD为2.31％。表明供试品溶液在24 h内基本稳定。
       2.8  加样回收率实验取已知含量的样品6份，分别加入补骨脂素和异补骨脂素混合对照品溶液，按制剂含量测定方法测定含量，计算加样回收率。结果见表1~2。
       2.9  样品含量测定取3批样品，依法测定补骨脂素和异补骨脂素含量。结果见表3。
       　　3  讨论
       3.1  曾以醋酸乙酯加热回流、索氏提取样品，但所提得的补骨脂素和异补骨脂素均不如甲醇的量多，可能是因为甲醇对样品的穿透力更强的缘故，故选择以甲醇为提取溶剂；考察了甲醇超声提取和回流提取的效果，结果回流提取液杂质较多，在进行HPLC分析时基线较高，不能很好地进行峰面积积分，而超声提取不但操作简便且提取液杂质较少，利于液湘分析，故选择超声提取；在对超声时间的考察中发现，超声1h即可将样品中的补骨脂素和异补骨脂素提取得较为完全，因此，确定样品的处理方法为甲醇超声1 h。
       表1  补骨脂素加样回收率实验结果（略）
       表2  异补骨脂素加样回收率实验结果（略）
       结果表明本方法回收率较好。
       表3  样品测定结果（略）
       3.2  曾考察过甲醇乙腈水的流动相系统，结果发现其稳定性不如甲醇水系统。在不同流动相配比、不同流速的实验中发现，流动相中甲醇所占份额越高，补骨脂素和异补骨脂素的保留时间越短，分离度越小，且流速对其分离度影响亦较大。经反复摸索，最终确定甲醇水（55∶45）为流动相，流速控制在0.85 ml・min-1，柱温控制在25℃，补骨脂素和异补骨脂素即可得到良好分离且重现性较好。
       3.3  补骨脂素和异补骨脂素的混合对照品溶液在200～400 nm波长范围进行光谱扫描，结果发现其最大吸收峰在245 nm处，因而确定检测波长为245 nm。
       3.4  本实验所建立的方法分离度好，稳定，简便易行，可较好地控制成药的质量。
       3.5  在检测方中所用补骨脂药材中补骨脂素和异补骨脂素的含量时，曾按《中国药典》规定方法及本实验方法对同一批药材分别进行了测定，发现两种方法测得的结果基本无差异（《中国药典》法测得的补骨脂素和异补骨脂素含量为1.06％，本实验方法测得的含量为1.08％），而《中国药典》规定对药材的处理采用索氏提取2 h［1］，就操作而言，不如本法简便。本法是否可代替《中国药典》方法作为补骨脂药材的含量测定方法有待日后对大量的药材进行检测的比较后确定，在此仅提供参考。
       　　参考文献：
       ［1］  国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005:129.
       (上海中医药大学附属曙光医院，上海  200021)