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       【关键词】  HPLC-ELSD法；,,愈伤灵胶囊；,,三七；,,人参皂苷Rg1；,,人参皂苷Rb1
       摘要：目的建立愈伤灵胶囊中人参皂苷Rg1和Rb1的含量测定方法。方法采用HPLC-ELSD法，色谱柱为Hypersil ODS2（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈-水梯度洗脱；蒸发光散射（ELSD）参数：漂移管温度为110 ℃，气体流量为3.02~3.05 SLPM。结果人参皂苷Rg1在2.272~11.360 μg范围内线性关系良好，r = 0.999 1；人参皂苷Rb1在2.232~11.160 μg范围内线性关系良好，r = 0.999 4；两者的平均回收率分别为96.6 %，98.6 %；RSD分别为1.7 %，2.3%。结论该法简便、准确、可靠，可用于愈伤灵胶囊的质量控制。
       关键词：HPLC-ELSD法；  愈伤灵胶囊；  三七；  人参皂苷Rg1；  人参皂苷Rb1
       Determination of Ginsenoside Rg1 and Rb1 in Yushangling Capsule by HPLC-ELSD
       SHI Yue, SUN Lan, CAO Yang, CHENG Xingye, ZHENG Shunliang
       （Institute of Medicinal Plant Development, Peking Union Medical College, Chinese Academy of Medical Sciences,  Beijing 100094, China）
       Abstract：ObjectiveTo establish an HPLC-ELSD method for determination of ginsenoside Rg1 and Rb1 in Yushangling capsule. MethodsThe separation was performed in a Hypersil ODS2 column with a mobile phase of acetonitrile-water in gradient elution, ELSD nebulization at 110 ℃ and flow rate of nitrogen at 3.02~3.05 SLPM. ResultsThe linear range of ginsenoside Rg1 was 2.272~11.360 μg, r = 0.999 1. The linear range of ginsenoside Rb1 was 2.232~11.160 μg, r = 0.999 4. The average recoveries of ginsenoside Rg1 and Rb1 were 96.6 %, 98.6 % respectively, and RSD were 1.7 %, 2.3%. ConclusionThis method is simple, accurate and reliable. It can be used for quality control of Yushangling capsule.
       Key words：HPLC-ELSD;  Yushangling capsule;  Radix notoginseng;  Ginsenoside Rg1;  Ginsenoside Rb1
   
　　愈伤灵胶囊为已有国家标准的药品，由三七、红花、土鳖虫、自然铜（煅）、冰片、续断、当归、黄瓜子（炒）和落新妇提取物九味药组成，该药具有活血散瘀，消肿止痛之功效，用于跌打挫伤，筋骨瘀血肿痛，亦可用于骨折的辅助治疗。三七为方中君药，系五加科植物三七Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen的干燥根。原质量标准［1］中未收载含量测定项，为有效控制愈伤灵胶囊的质量，本实验利用HPLC-ELSD法对处方中三七的指标成分人参皂苷Rg1和Rb1含量进行了测定，并对该方法学进行考察，建立了一套准确、快速、同时测定人参皂苷Rg1和Rb1含量的定量方法，可作为愈伤灵胶囊质量控制的定量指标。
       　　1  材料与方法
       1.1  材料
       1.1.1  仪器Waters 600高效液相色谱仪（Waters 600E型泵，Alltech 500型蒸发光散色检测器， Millennium32化学工作站）；METTLER AB135-S型十万分之一电子天平；KQ-250DB型数控超声波清洗器。
       1.1.2  药品与试剂愈伤灵胶囊由大连天山药业有限公司提供，人参皂苷Rg1（批号为110703-200322，供含量测定用）和人参皂苷Rb1（批号为110704-200318，供含量测定用）对照品购自中国药品生物制品检定所，乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其它试剂均为分析纯。
       1.2  方法
       1.2.1  对照品溶液的制备精密称取人参皂苷Rg1对照品适量，加甲醇制成每毫升含0.568 mg的溶液。精密称取人参皂苷Rb1对照品适量，加甲醇制成每毫升含0.558 mg的溶液，备用。
       1.2.2  供试品溶液的制备取本品内容物约2 g，精密称定，置三角瓶中，加入甲醇100 ml，加热回流1 h，放冷，滤过，用甲醇洗涤滤纸和滤器，滤液回收甲醇并浓缩至干，残渣加水30 ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次30 ml，合并正丁醇提取液，正丁醇液水浴蒸干，残渣加甲醇使溶解并完全转移至25 ml量瓶中，以甲醇稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，备用。
       1.2.3  含量测定色谱条件与系统适应性实验色谱柱为Hypersil ODS2（4.6 mm×250 mm, 5 μm）；流动相A为乙腈，流动相B为水，梯度洗脱条件：0~5 min，20％→30％A；5~15 min，30％→40％A；15~25 min，40％A；流速1.0 ml/min；柱温25 ℃；进样量10 μl；蒸发光散射（ELSD）参数：漂移管温度110 ℃，气体流量3.02~3.05 SLPM。在上述色谱条件下，对愈伤灵胶囊进行测定，测定后按外标两点法常用对数计算含量。对照品、样品、阴性对照色谱图见图1。结果表明，人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1与杂质峰没有重叠，分离效果好（人参皂苷Rg1分离度2.1，人参皂苷Rb1分离度1.5），理论板数以人参皂苷Rg1峰计不低于2 500。
       　　2  结果
       2.1  线性关系考察分别精密量取上述对照品溶液各4，8，12，16，20 μl，注入液相色谱仪中，测定，分别以人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1进样量的常用对数为横坐标，相应峰面积积分值的常用对数为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。人参皂苷Rg1：Y = 1.723 0X + 4.905 2，r= 0.999 1，线性范围：2.272~11.360 μg；人参皂苷Rb1：Y = 1.770 7X+ 4.847 2，r= 0.999 4，线性范围：2.232~11.160 μg。
       图1  人参皂苷Rg1和Rb1的HPLC-ELSD测定图谱（略）
       2.2  精密度实验按2.2方法制备供试品溶液，连续进行5次测定，每次进样10 μl。人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1峰面积积分值的平均值分别为1 887 177，879 453，其RSD分别为0.87%，1.04%，表明仪器精密度良好。
       2.3  稳定性实验精密吸取同一批供试品溶液，分别于0，4，8，12，24 h时间间隔各进样10 μl分析，结果人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1峰面积积分值的平均值分别为2 119 284，765 970，RSD分别为1.62 %，1.52 %，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
       2.4  重复性实验对同一批样品分别称取5份，按2.2方法操作，按2.3色谱条件测定，每次进样10 μl，结果人参皂苷Rg1的平均含量为2.179 mg/粒，RSD为0.60 %；人参皂苷Rb1的平均含量为1.478 mg/粒，RSD为0.46 %，表明其重现性良好。
       2.5  回收率实验采用加样回收法。取己知含量的样品5份，精密称定，分别加入一定量的人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1对照品，按2.2方法制备供试品溶液，按2.3色谱条件测定，计算回收率。结果见表1~2。
       表1  人参皂苷Rg1加样回收率实验结果（略）
       表2  人参皂苷Rb1加样回收率试验结果（略）
       2.6  样品的含量测定按2.2方法制备样品溶液，按2.3色谱条件对9批样品进行含量测定，结果见表3。
       表3  样品含量测定结果（略）
       　　3  讨论
       3.1  色谱条件的确定关于三七中皂苷类成分的含量测定已有一些文献报道［1~5］，但利用HPLC-ELSD法对愈伤灵胶囊中三七的指标性成分人参皂苷Rg1和Rb1含量同时测定尚未见研究。经试验考察，人参皂苷Rg1和Rb1在同一色谱条件下，同时测定两者，所需时间较长；而采用梯度洗脱，则可大大节省分析时间，最后确定乙腈-水梯度洗脱，可使人参皂苷Rg1和Rb1获得很好的分离。采用HPLC-ELSD法测定人参皂苷Rg1和Rb1含量时，其峰面积积分值与对照品浓度的线性关系不很理想，而将峰面积积分值与对照品浓度值分别取自然对数后，可得到理想的线性关系，这种现象与ELSD检测器的检测机理是一致的［6］。
       3.2  提取条件的选择  实验中选择甲醇为溶剂，比较了超声提取法和回流提取法以及提取时间对人参皂苷Rg1和Rb1含量的影响，结果表明采用甲醇回流提取1 h，样品中人参皂苷Rg1和Rb1已基本提取完全。由于甲醇提取后直接进样分析测定，样品颜色较深，故采用水饱和正丁醇净化处理，经实验考察，甲醇提取后，水饱和正丁醇净化，所测人参皂苷Rg1和Rb1的含量差别不大，但杂质被大量除去，样品颜色浅，易于含量测定。
       　　参考文献：
       ［1］  朱  洁，温  敏，张洪彬. HPLC-ELSD测定三七胶囊中人参皂苷Rg1和Rb1［J］. 中成药，2004，26（1）：33.
       ［2］  黄永焯，王宁生. HPLC/ELSD法结合固相萃取测定三七中人参皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1的含量［J］. 中药新药与临床药理，2003，14（3）：180.
       ［3］  胡晓斌，李颖，吴苏澄，等. 生脉胶囊中人参皂苷Rg1、Re的HPLC测定［J］. 中药新药与临床药理，2003，14（1）：49.
       ［4］  潘桂湘，高秀梅，张伯礼. HPLC测定复方丹参方中三七皂苷类成分的含量［J］. 中药新药与临床药理，2003，14（2）：112.
       ［5］  杨南林，吴永江，程翼宇. 反相高效液相色谱法同时测定三七药材中4种皂苷的含量［J］. 分析化学，2003，31（6）：731.
       ［6］  冯埃生，邹汉法，汪海林，等. 影响高效液相色谱／挥发激光散射检测器检测性能基本因素的考察［J］. 药物分析杂志，1996，16（6）：414.
       (中国医学科学院 中国协和医科大学 药用植物研究所，北京 100094)