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       【关键词】  何首乌；,,高效液相色谱法；,,醋酸镁比色法
       摘要：目的考察炮制时间对何首乌中有效成分2，3，5，4四羟基二苯乙烯2OβD葡萄糖苷(简称二苯乙烯苷)和蒽醌类化合物含量的影响。方法何首乌分别采用黑豆汁拌蒸0，2，4，6，8，10 h。HPLC测定炮制饮片中二苯乙烯苷的含量；醋酸镁比色法分别测定炮制饮片中游离蒽醌和总蒽醌的含量。结果用黑豆汁拌蒸的何首乌饮片10 h内二苯乙烯苷含量随炮制时间先逐渐上升而后下降，以6 h为峰；游离蒽醌含量逐渐升高,总蒽醌含量没有显著性变化。结论 应规范何首乌饮片的炮制时间。
       关键词：何首乌；  高效液相色谱法；  醋酸镁比色法
       Influence of Process Methods on Contents of Chemical Component in Radix Polygoni Multiflori
       REN Lijian, JIN Yong, YIN Shouyu*
       (College of Pharmacy, Yanbian University, Yanji 133000,China )
       Abstract：ObjectiveTo investigate the effects of different time of processing Radix Polygonum Mutiflorum on the contents of chemical components 2，3，5，4-stilbene glucoside and anthraquinone were investigated .MethodsSteamed with black bean sauce for 0,2,4,6,8,10h respectively. HPLC was used to determine the content of 2，3，5，4-stilbene glucoside. The colorimetry with magnesium acetate as color-developing reagent was applied．The content of free and total anthraquinone were determined. ResultsIn the process of black bean sauce stewing，the content of 2，3，5，4-stilbene glueoside increased with processing time，6h reached the most and then decreased. The content of free anthraquinone increased with processing time and total anthraquinone almost unchanged. ConclusionThe processing of Radix Polygonum Mutiflorum should be standardized to avoid significant variation of chemical contents．
       Key words：Radix Polygoni Multiflori；  HPLC；  Magnesium acetate colorimetry spectrophotometric method
   
　　何首乌为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb.的干燥块根,为常用中药。生品具有解毒、消痈、润肠通便之功效。制首乌具有补肝肾、益精血、乌须发、增强免疫力、改善记忆障碍及抗衰老等功效［1］。何首乌中主要有效成分为蒽醌类和二苯乙烯化合物。结合蒽醌具有泻下作用，何首乌经炮制后结合蒽醌逐渐转为无泻下作用的游离蒽醌［2］。二苯乙烯苷具有抗衰老、降低胆固醇、提高免疫功能、防治动脉硬化及保肝等作用，在何首乌中的含量较高。现有的炮制方法有多种，但各种方法均未规范其炮制时间。炮制时间的长短对其各个成分的含量影响较大，探明其在炮制前后主要成分变化是很有必要的。本实验选择《中国药典》中规定的黑豆汁拌蒸法，考察不同时间的黑豆汁拌蒸工艺对何首乌中主要化学成分的影响。
       1  器材
       日本岛津高效液相色谱仪，SPD10VAP型紫外检测器；FA2004电子天平；UV2201型紫外-可见分光光度计(日本Shimadzu)；AS3120型超声波清洗器(奥特赛思仪器有限公司)。何首乌药材由吉林敖东药业集团股份有限公司提供，经鉴定均为蓼科植物何首乌的干燥块根。实验样品为实验室自制的何首乌生饮片，经黑豆汁拌蒸0，2，4，6，8，10 h的饮片。黑豆汁拌蒸法：取黑豆适量（1/10何首乌的量），加适量的水煎煮2次，用200目筛绢滤出，合并滤液，浓缩至约黑豆的2.5倍。将黑豆汁加入何首乌饮片中，拌匀，浸润24 h，取出浸润后的何首乌适量作为0 h饮片单放，其余的按2，4，6，8，10 h进行蒸制。二苯乙烯苷(供含量测定用，中国药品生物制品检定所，批号110844-200404)；1，8-二羟基蒽醌对照品(供含量测定用，中国药品生物制品检定所，批号08299702)；乙腈为色谱纯(美国Fisher公司)；水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
       　2  方法与结果
       2.1  蒽醌的含量测定
       2.1.1  对照品溶液的制备  精密称取经105℃干燥至恒重的1，8-二羟基蒽醌对照品5.1 mg，置25 ml容量瓶中，甲醇溶解并定容，作为对照品溶液。
       2.1.2  供试品溶液的制备  取各何首乌饮片粉末(过80目筛)0.5 g，精密称定，置50 ml容量瓶中，加入氯仿40 ml，超声处理40 min，放冷，用氯仿稀释至刻度，摇匀，过滤,取续滤液作为供试品溶液［1］。另取各何首乌饮片粉末(过80目筛)0.5 g，精密称定，置150 ml锥形瓶中，加30 ml氯仿和30 ml硫酸（2.5 mol・L-1），水浴回流水解2 h，放冷，水解液置分液漏斗中，分取氯仿层于50 ml容量瓶中，水层用氯仿洗涤(5 ml×3)，洗液并入容量瓶中，并用氯仿稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液［2］。
       2.1.3  线性关系考察  精密吸取“2.1.1” 项下的对照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml置l0 ml容量瓶中，置水浴上蒸干，放冷，将残渣用0.035 mol・ L-1醋酸镁-甲醇溶液溶解并定容，以0.035 mol・L-1醋酸镁-甲醇溶液为空白，在510 nm测定吸光度，以吸光度（Y）为纵坐标，浓度( X，μg・ml-1)为横坐标绘制标准曲线，得回归方程为：Y=0.049 9X+0.003 6 (r=0.999 9)，表明1，8-二羟基蒽醌在4.08～20.40 μg范围内线性关系良好。
       2.1.4   精密度实验  精密吸取“2.1.1”项下的对照品溶液0.5 ml，按醋酸镁比色法测定5次，测得吸光度的RSD为0.34%。
       2.1.5   回收率实验  精密称取已知含量的样品5份，每份0.5 g，置50 ml容量瓶中，加入1 ml对照品溶液，再加入氯仿40 ml，超声处理40 min。放冷，氯仿定容，摇匀，过滤。精密吸取续滤液8 ml，置l0 ml容量瓶中，水浴蒸干，放冷，得残渣。按醋酸镁比色法测定，计算1，8一二羟基蒽醌的回收率。结果其平均回收率为98.06%+1.98%（n=5）。    
       2.1.6   测定方法与结果  精密吸取“2.1.2”项下的供试品溶液［1］8 ml，置10 ml容量瓶中，水浴蒸干，放冷，得残渣。按醋酸镁比色法在510 nm测定吸光度，计算游离蒽醌的含量，结果见表1。精密吸取“2.1.2”项下的供试品溶液［2］4 ml，置10 ml容量瓶中，蒸干，放冷，得残渣。按醋酸镁比色法在510 nm测定吸光度，计算样品中总蒽醌的含量。由此，总蒽醌含量减去游离蒽醌含量，即得结合蒽醌含量。结果见表1。
       2.2  二苯乙烯苷的含量测定
       2.2.1  色谱条件［3］   色谱柱：C18-PAQ (4.6 mm×250 mm，5μm)；流动相：乙腈-水（25∶75）；检测波长：320 nm ；流速：1.0 ml/min。
       2.2.2   对照品溶液的制备  精密称取二苯乙烯苷对照品适量，加稀乙醇溶解制成0.21mg・ml-1的溶液，作为对照品溶液。
       2.2.3  供试品溶液的制备  取各何首乌饮片粉末(过80目筛)0.2 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入稀乙醇25 ml，称定重量。加热回流30 min，放冷，再称重，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
       2.2.4  线性关系考察  精密吸取对照品溶液2，4，6，8，10，12，14，16，20 μl注入液相色谱仪，测定峰面积值，以色谱峰面积积分值为纵坐标（Y），以进样量（X，μg）为横坐标进行线性回归，得线性方程为Y=4×106X+218 758，r=0.999 9（n=9），表明二苯乙烯苷在0.41～4.20 μg范围内线性关系良好。
       2.2.5  精密度实验  精密吸取对照品溶液，重复进样5次，10 μl/次，测得峰面积积分值的RSD为1.06% 。
       2.2.6  重现性实验  精密称取同一何首乌饮片5份，按“2.2.3”项下的方法处理，进样，测得供试品中二苯乙烯苷含量的RSD为1.83% 。
       2.2.7  稳定性实验  取何首乌饮片，按“2.2.3”项下的方法处理，分别在0，4，8，16，24 h进样，测定峰面积积分值的RSD为1.19%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
       2.2.8  回收率实验  精密称取已知二苯乙烯苷含量的何首乌粉末5份，置锥形瓶中，分别精密加入对照品溶液2 ml，按“2.2.3”项下的方法处理，进样，测定峰面积积分值，计算二苯乙烯苷回收率为99.3%，RSD为1.41%(n=5)。
       2.2.9  样品的含量测定  精密吸取各供试品溶液10 μl，进样，测定峰面积积分值,计算样品中二苯乙烯苷含量。结果见表1。
       表1   不同炮制时间何首乌中有效成分的含量测定结果（略）
       3  讨论
　　
　　关于炮制后何首乌中有效成分含量变化已有报道［4］，但均是以制后结合蒽醌几乎转变成游离蒽醌为炮制目的,所以选定的炮制时间长(一般大于12 h)，且时间间隔也很大。根据吉林敖东药业集团股份有限公司“安神补脑液的第2次开发”的需要，本文首次已2 h为间隔时间探讨了黑豆汁拌蒸10 h之内的有效成分含量的变化。本实验结果显示，用黑豆汁拌蒸不同时间蒽醌含量有差异，蒸制2~10 h，游离蒽醌的含量随炮制时间的延长逐渐升高，但总蒽醌含量只略有下降，无显著性差异，说明结合蒽醌在炮制过程中逐渐转变为游离蒽醌。经多次（n=6）实验测得黑豆汁拌蒸10 h时已有46.5%的结合蒽醌转变为游离蒽醌。本实验结果显示，用黑豆汁拌蒸不同时间(0～10 h)，何首乌饮片中二苯乙烯苷的含量随炮制时间先逐渐升高而后逐渐降低,至6h时含量最高（略低于生品）。本实验还探讨了传统工艺炮制品（九蒸九晒）中二苯乙烯苷的含量，其结果为：传统工艺炮制品＞生品＞黑豆汁拌蒸品。实验中发现蒸制时间的长短与其颜色也有着重要的关系，蒸制时间短，颜色暗淡无光泽；蒸制时间越长，其颜色逐渐乌黑发亮。实验中也意外地发现，黑豆汁浸润24 h的何首乌（即0 h样品）中游离蒽醌的含量特别高，其原因有待进一步研究。
       参考文献：
       ［1］  郑虎占.中药现代研究与应用，第3卷［M］.北京：学苑出版社 ，1998.
       ［2］  王孝涛，曹  晖，刘玉萍.中药采制与炮制技术［M］.北京：华夏出版社，2000：23.
       ［3］  国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：123.
       ［4］  刘振丽，宋志前，张  玲.不同炮制工艺对何首乌中成分含量的影响［J］.中国中药杂志，2005，30（5）：336.
       （延边大学医学院，吉林 延吉  133000）