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       【摘要】 
       目的优选出金银花最佳采收阶段和产地加工方法。方法用高效液相色谱（HPLC）法测定不同采收期和不同加工方法的金银花中绿原酸的动态变化。结果确定金银花的最佳采收期为三青、二白和大白阶段，产地加工可采用直接晒干和烘干等方法。结论 此研究为道地药材封丘金银花的质量控制提供参考。
       【关键词】  高效液相色谱； 采收期； 产地加工； 道地药材
       
       The Quality Evaluation of the Different Collection Periods and Processing Technologies of Flos Lonicerae in Henan
       WANG Shumei， CUI Yongxia， WU Mingxia， LIANG Shengwang
       1. Henan College of TCM, Henan, Zhengzhou 450082, China；
       2.Beijing University of TCM, Beijing, 100102, China;
       3.Guangdong College of Pharmacy, Guangzhou 510024,China
       Abstract：ObjectiveTo optimize the best stage of collection and the process method in the producing area of Flos Lonicerae.MethodsThe contents of Chlorogenic acid of  Flos Lonicerae which were collected in different stages and processed by different methods were determined by HPLC.ResultsThe best collection period and the process technologies were determined.ConclusionThis study provides a reference to the quality control of famousregion drug.
       Key words：HPLC;   Collection period;   Processing technololgy;   Famousregion drug
        金银花为一常用中药，是忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花，具有清热解毒、疏散风热之功效。河南封丘金银花为道地药材［1］。本实验针对河南封丘GAP基地金银花进行不同采收期和不同加工方法的研究，为道地药材合理的开发和利用提供依据。
       1  器材
        2010A高效液相色谱仪（日本岛津），PDAD检测器；电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；甲醇（天津科密欧化学试剂开发中心，色谱纯）；乙腈（江苏百林试剂厂，色谱纯）；磷酸（开封化学试剂厂，分析纯）；绿原酸对照品（中国生物制品检定所）。
        金银花药材分别于200405～200409采自封丘金银花生产基地，分为三、二白、大白、银花、金花5个阶段，每样品按照不同地点采收3批。经河南中医学院曹继华教授鉴定为忍冬科正品金银花。
       2  方法与结果
       2.1  药材最佳采收期研究金银花从幼蕾开放大致可分为幼蕾（绿色的小花蕾，长约1 cm），三青（绿色花蕾，长2.1～3.4 cm），二白（淡白色花蕾长3～3.9 cm），大白（白色花蕾，长3.6～4.3 cm），银花（刚开放的白色花蕾，长3.8～4.5 cm），金花（花变黄色，长3.6～4.3 cm），凋花（棕黄色，稍有干枯）等7个阶段［2］，由于幼蕾太小，产量低，凋花质轻色泽较差，因此商品常包括5个阶段的花，花区常因花期集中（盛花期3～7 d），往往将花一起采下。封丘金银花一般一年收两季，第1次是在5月份左右，第2次采收期在9月份。我们采用高效液相色谱法对不同采收期的各样品进行绿原酸的含量测定，以确定金银花的最佳采收期。
       2.2   绿原酸的动态变化研究
       2.2.1  色谱条件
       色谱柱：C18（Hanbon Science &Technology Co.Ltd）；流动相：乙腈-磷酸水（0.4%）15∶85；λs=327 nm；流速1 ml/min；进样量5 μl；柱温30℃。
       2.2.2  对照品溶液的制备
       精密称取绿原酸对照品适量，加甲醇溶解配制成46.0μg/ml的对照品溶液。
       2.2.3  供试品溶液的制备
       取各样品粉末约0.5 g，精密称定，置锥形瓶中，加入50%的甲醇50 ml，精密称定，超声处理30min，取出，放凉，称重，用50%的甲醇补足减失的重量，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液5 ml，用50%甲醇定容至25 ml，0.45 μm的滤膜滤过，即得各供试品溶液。
       2.2.4  线性关系考察
       精密吸取对照品溶液各4，8，12，16，20 μl注入液相色谱仪，以对照品的量为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，线性关系良好。
        Y＝3 135 429.891X－8 202.3 （r＝0.999 9）
       2.2.5  精密度实验
       精密吸取对照品溶液5 μl ，按照上述色谱条件连续进样5次，依法测定，以绿原酸峰面积计算，RSD=0.45%，符合要求。
       2.2.6  重现性实验
       精密吸取封丘供试品溶液5 μl，按照上述色谱条件连续进样5次，依法测定，以绿原酸峰面积计算，RSD=1.02%，符合要求。
       2.2.7  稳定性实验
       精密吸取同一份供试品溶液5μl，按照上述色谱条件在0，0.5，1，2，4 h进行测定，以绿原酸峰面积计算，得RSD=0.89%，符合要求。
       2.2.8  加样回收率实验
       取已知含量的金银花生药粉末，精密称取6份适量，分别精密加入绿原酸对照品适量，按照供试品溶液的制备方法得到样品溶液，再照上述色谱条件进行绿原酸的含量测定，计算回收率。结果见表1。表1  样品绿原酸回收率结果（略）
       2.2.9  样品的测定 
       分别精密吸取上述各供试品溶液及对照品溶液各5 μl，按照上述色谱条件进行测定，将所得绿原酸峰面积带入回归方程计算，得到不同采收期金银花绿原酸含量。结果见表2。表2  不同采收期药材中绿原酸的含量（略）
       2.3  不同产地加工方法的研究［3,4］
       2.3.1  采摘方法 
       忍冬花从花开期到花末期共大概30 d的时间，其花蕾密集生于小花枝上，采摘时间最好为晴天上午露水干后采摘。采摘金银花的盛器必须通风透气,一般使用竹篮或条筐,不能用书包、提包或塑料袋,以防采摘下来的花蕾蒸发的水分不易挥发再浸湿花蕾,热量不易散失而发热发霉变黑等，采摘的花蕾均轻轻放入盛具内，不能紧压，避免伤花及发热，要做到“轻摘、轻握、轻放”。这样的鲜品经加工后，成色好，香气浓郁，能保持良好的生药性状。
       2.3.2  产地加工方法的研究
        直接晒干法:鲜品采回后，松散地薄薄地摊于竹篾或干净的水泥地上暴晒，但温度不宜超过40℃。尽量少翻动，否则花色欠佳或花蕾断碎，更不可将花堆积日久，否则花色会变成黑褐色。晒干法简便易行，但须天气晴朗，一天内可晒至6～7成干。及时暴晒至干者，颜色是黄绿相间的，但颜色不太稳定，放置过久可能会变成棕黄色，需反复晾晒至完全干燥后置干燥器中保存。
        直接阴干法和烘干法:阴干是把鲜品置通风处薄摊凉干，烘干则是把鲜品置烘箱中或炕上，分层薄摊，于60℃左右烘干。此两法干燥时，一定要薄摊，亦忌随意翻动。所得样品与晒干者相似，也需完全干燥后密封保存。
        水洗后烘干：因封丘地处黄河滩，风沙较大，自行采集一些生品用水迅速淋洗后，于60℃烘干，烘干时要薄摊，忌随意翻动，所得样品与晒干者相似，完全干燥后密封保存。
       2.3.3  不同加工品的含量测定
        供试品溶液的制备方法：分别取上述4种加工方法制得的样品粉末约0.5 g，精密称定，置锥形瓶中，加入50%的甲醇50 ml，精密称定，超声处理30 min，取出，放凉，称重，用50%的甲醇补足减失的重量，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液5 ml，用50%甲醇定容至25 ml，0.45 μm的滤膜滤过，即得各供试品溶液。
        样品的测定：分别精密吸取上述各供试品溶液及对照品溶液各5 μl，按照上述色谱条件进行测定，将所得绿原酸峰面积带入回归方程计算，得到不同加工方法的金银花中绿原酸的含量。结果见表3。表3  不同加工方法药材中绿原酸的含量（略）
       2.3.4  不同加工方法对灰分和酸不溶性灰分的影响［5］测定方法：分别取上述4种加工方法制得的金银花，粉碎使能够全部通过2号筛，混合均匀后取样品约3 g，精密称定，置炽灼至恒重的坩埚中，称定重量，缓缓炽热，注意避免燃烧，至完全炭化时逐渐升高温度至550℃，使完全灰化并至恒重。根据残渣重量，计算供试品中总灰分的含量。利用上面所得灰分，在坩埚中加入稀盐酸约10 ml，用表面皿覆盖坩埚，置水浴上加热10 min，表面皿用热水5 ml冲洗，洗液并入坩埚中，用无灰滤纸滤过，坩埚内的残渣用水洗于滤纸上，并洗涤至洗液不显氯化反应为止。滤渣连同滤纸移至同一坩埚中，干燥，炽灼至恒重根据残渣重量，计算供试品中酸不溶性灰分的含量。结果见表4。表4   金银花灰分和酸不溶性灰分测定结果（略）
       2.3.5  不同加工方法样品的重金属限量检查标准铅溶液的配制：精密称取在105℃干燥至恒重的硝酸铅0.159 8 g，置1 000 ml量瓶中，加硝酸5 ml，水50 ml溶解后，用水稀释至刻度，摇匀，作为储备液。
        临用前，精密量取储备液10 ml，置100 ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得（每毫升相当于10 μg的Pb）。
        硫代乙酰胺试液的配制 ：取硫代乙酰胺4 g，加水使溶解成100 ml，置冰箱中保存。临用前取混合液（由1 mol/L氢氧化钠溶液15 ml，水5.0 ml及甘油20 ml组成）5.0 ml，加上述硫代乙酰胺溶液1.0 ml，置水浴上加热20 s，冷却，立即使用。
        醋酸盐缓冲液的配制（pH 3.5）：取醋酸铵25 g，加水25 ml溶解后，加7 mol/L盐酸溶液38 ml，用2 mol/L盐酸溶液或5 mol/L氨溶液准确调节pH值至3.5（电位法指示），用水稀释至100 ml，即得。
        检查方法：分别取上述4种加工方法制得的金银花药材粉末约1.0 g，精密称定。缓缓炽灼至完全炭化（或在电炉上缓缓加热至冒白烟，但不得起明火），放冷至室温，加硫酸0.5 ml，使润湿，低温加热硫酸蒸气除尽后，再在马福炉中500～600℃炽灼至恒重，放冷，加硝酸0.5 ml蒸干，至氧化氮蒸气除尽后，放冷，加盐酸2 ml，置水浴上蒸干后，加水15 ml，滴加氨试液至酚酞指示液显中性，再加醋酸盐缓冲液（pH 3.5）2 ml,微热溶解后，完全转移至纳氏比色管中，加水稀释成25 ml。另取配制供试品溶液的试剂，置瓷皿中蒸干后，加醋酸盐缓冲液（pH 3.5）2 ml与水15 ml，微热溶解后，移至纳氏比色管中，加标准铅溶液2.5 ml，再用水稀释成25 ml，再在样品与对照品纳氏比色管中分别加硫代乙酰胺试液2 ml，摇匀，放置2 min。
        结果：将样品管与对照品管同置白纸上，自上向下透视，样品管与对照品管比较，颜色均浅于对照品管，且样品管颜色基本一致，故重金属限量均小于10 μg/g。
       2.3.6  不同加工方法样品的砷盐限量检查［5］标准砷溶液的制备：称取三氧化二砷0.132 4 g，置1 000 ml量瓶中，加20%氢氧化钠溶液5 ml溶解后，用适量的稀硫酸中和，再加稀硫酸10 ml用水稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。临用前，精密量取贮备液10 ml，置1 000ml量瓶中，加稀硫酸10 ml,用水稀释至刻度摇匀，即得（每毫升相当于1 μg的砷）。
        碘化钾试液的配制：取碘化钾16.5 g，加水使溶解成100 ml，即得。本液应临用新配。
        酸性氯化亚锡试液的配制：取氯化亚锡20 g，加盐酸使溶解成50 ml,放置过夜，即得。
        标准砷斑的制备：精密量取标准砷溶液2 ml,置A瓶中，加盐酸5 ml与水21 ml，再加碘化钾试液5 ml与酸性氯化亚锡试液5滴，在室温放置10 min后，加锌粒2 g，立即将装妥的导气管C密塞与A瓶上，并将A瓶置25～40℃水浴中反应45 min，取出溴化汞试纸，即得。
        供试品砷斑的制备：分别取上述4种加工方法制得的金银花药材粉末约2.0 g，精密称定，加等量氢氧化钙，加水少量调匀呈糊状，干燥后，先用小火使炭化，再在550～600℃炽灼至完全灰化，取出放冷。将灰化后的样品置A瓶中，加盐酸中和，再加盐酸5 ml与水适量使成28 ml，同上标准砷斑的制备方法。
        结果：将供试品生成的砷斑与标准砷斑相比较，颜色均浅于标准砷斑，且颜色深浅依次为：阴干品＞烘干品＞晒干品＞淋洗品,故砷盐限量为2 μg/g。
       3  结论
       3.1  从表2可知，不同采收期金银花中绿原酸的含量由高到低的顺序为三青＞二白＞大白＞银花＞金花，即花蕾的前三个阶段绿原酸的含量最高，但也呈现出逐步降低的现象，而且5月份采收的样品绿原酸的含量一般高于同种阶段9月份的样品含量，因此我们定于金银花的早期阶段为金银花的最佳采收期。
       3.2  由表3可知，不同的加工方法对金银花中绿原酸的含量有很大影响，尤其是阴干法样品中绿原酸的含量最低，可能是由于干燥时间太长，干燥条件不易控制所致。如果条件允许，应尽量避免用阴干法干燥。有关文献还报道了金银花的其它加工方法如炒鲜处理后干燥、蒸气处理后干燥、硫磺熏干法等，这些方法相对较为繁琐，在产地加工时很少应用，故本实验没有对这些方法深入研究。
       3.3  由表4可知，金银花鲜品迅速淋洗后，灰分和酸不溶性灰分及砷盐含量明显减低，可考虑在产地加工时将所采鲜品迅速淋洗，来提高其质量控制指标。
       3.4  综上所述，封丘GAP生产基地提供的金银花质量较为稳定，有效成分绿原酸的含量较高。为了保证用药的有效性和合理性，建议此基地的金银花在5月初期花未开或将开时采收，并对采收后的样品迅速淋洗后晒干或烘干，以提高其用药的安全性。
       【参考文献】
         　　［1］邢俊波，李 萍，刘 云.不同产地、不同物候期金银花中绿原酸的动态变化研究［J］.中国药学杂志，2003，38（1）：19.
       
       ［2］邢俊波，李 萍，温德良，等.不同物候期金银花中总绿原酸的积累动态研究［J］.中国中药杂志，2001，26（7）：457.
       
       ［3］王桂英，田谨为.金银花的采收加工方法及其成品性状比较［J］. 中草药，1996，27（4）：233.
       
       ［4］徐晓光，程存良.金银花的硫磺熏晒法［J］.基层中药杂志，1994，8（1）：10.
       
       ［5］国家药典委员会，中国药典，Ⅰ部［S］. 北京：化学工业出版社，2005：IXE，IXF.