文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的观察4种荨麻属植物的8种不同提取物对骨形成的影响。方法以成骨样细胞MC3T3-E1为靶细胞，以表皮生长因子为阳性对照，4种荨麻属植物的8种不同提取物分为50，100，200 μg/ml 3个浓度组，采用CCK-8 (cell counting kit-8) 活细胞计数法测定4种荨麻属植物的8种不同提取物对成骨样细胞MC3T3-E1的增殖作用，同时测定碱性磷酸酶的活性。结果三角叶荨麻根的醇提物，宽叶荨麻全草的醇提物和醇提物水层过D101大孔树脂40%洗脱部分在50到200 μg/ml 的浓度下能显著促进成骨样细胞MC3T3-E1增殖。同时这3种提取物一定程度上也增强了碱性磷酸酶的活性，但无显著性差异。结论三角叶荨麻和宽叶荨麻提取物在体外对成骨样细胞MC3T3-E1的作用提示其在体内可能促进骨形成过程。
       【关键词】  荨麻属植物； 成骨细胞； 增殖； 碱性磷酸酯酶； 活性
       Effect of Urtica Plants on Bone Formation
        SHI Liying, YAN Xingguo,ZHOU Yuan,TANG Ling, FENG Baomin, WANG Yongqi*
        (Pharmacological Institute, Dalian University, Dalian 116622, China)
        Abstract：ObjectiveTo study the effect of eight extracts of four Urtica plants on bone formation. MethodsOsteoblastic MC3T3-E1 cell was used as the target cell, epidermal growth factor was used as positive control, MC3T3-E1 cells were cultured and tested for growth with various concentrations of samples in the medium. The proliferation effect of eight extracts of four Urtica plants on clone MC3T3-E1 cells was examined with cell counting kit-8 (CCK-8) and alkaline phosphatase (ALP) activity was also determined. ResultsWe found that EtOH extract from the root of U. triangularis, EtOH extract and 40% EtOH-H2O fraction with D101 macroporous resin from the H2O partition of EtOH extract from the whole plant of U. laetevirens Maxim. subsp. laetevirens at the concentration of 50 to 200 μg/ml significantly stimulated MC3T3-E1 cell proliferation. The three extracts also somewhat increased ALP activity, but had no significant difference. ConclusionThese effects of EtOH extract from the root of U. triangularis, EtOH extract and 40% EtOH-H2O fraction with D101 macroporous resin from the H2O partition of EtOH extract from the whole plant of U. laetevirens Maxim. subsp. laetevirens on MC3T3-E1 cells in vitro suggest that they may stimulate bone formation in vivo as well.
        Key words：Urtica Plants;   Osteoblast;   Proliferation;   Alkaline phosphatase;   Activity
        骨形成和骨吸收是骨代谢的两个基本过程，通常骨形成与骨吸收之间保持平衡，即成骨细胞与破骨细胞保持功能性偶联，但是当某种原因使这种功能性偶联破坏，骨吸收超过骨形成导致骨量减少时即可引起骨质疏松［1，2］。成骨细胞和破骨细胞都是骨代谢过程中的重要核心细胞，而成骨细胞不仅参与骨形成，而且还参与破骨细胞性骨吸收的调节［1，2］。成骨细胞的主要功能有：合成、分泌胶原与糖蛋白，形成骨基质，并通过碱性磷酸酶等多种酶介导骨组织的矿化过程；参与破骨细胞性骨吸收的调控作用，同时成骨细胞作为破骨细胞的辅助细胞参与骨的吸收、分解；维持骨的代谢平衡，骨的代谢及改建的主要功能细胞是成骨细胞与破骨细胞的协同作用，在多种细胞因子的调控下，通过复杂分子机制完成骨代谢平衡［3］。
        近几年来很多学者从细胞分子生物学角度开展了中药对成骨细胞影响的实验研究，为中药防治骨质疏松提供了分子生物学理论依据［4，5］。本文通过建立与骨形成相关的成骨细胞培养体系，考察了4种荨麻属植物对骨形成的影响。
        荨麻科荨麻属Urtica L.植物三角叶荨麻U. triangularis，宽叶荨麻U. laetevirens Maxim. subsp. laetevirens，滇藏荨麻U. mairei Levl.，裂叶荨麻U. fissa为常用的民族药和民间药，具有祛风通络、平肝定惊、消积通便、解毒等功效，汉族、布依族、傈僳族、藏族等多个民族主要用于风湿性关节炎、风疹等病的治疗［6，7］，而对这4种荨麻属植物的抗骨质疏松作用未见报道。本文以成骨样细胞　MC3T3-E1为靶细胞，考察了4种荨麻属植物的8种不同提取物对其增殖作用的影响，并检测了相应的碱性磷酸酶的活性。
           1  材料
        小鼠成骨样细胞MC3T3-E1细胞株由日本富山大学医学部宫原龙朗教授提供；表皮生长因子购自日本Funakoshi 公司；前列腺素E2购自日本Biomol International实验室；小牛血清购自美国JRH Biosciences公司；α-MEM为美国ICN Biomedicals公司产品；活细胞计数试剂盒CCK-8 (cell counting kit-8) 购自日本Dojin实验室。
        2  方法
        2.1  靶细胞以小鼠头顶骨细胞系MC3T3-E1为靶细胞，采用对照观察的方法，以表皮生长因子为阳性对照，同时设正常对照组（不加药，只加等量细胞悬液和培养基）和空白对照组（不加药和细胞悬液，只加等量培养基）。4种荨麻属植物的8种不同提取物分为50，100，200 μg/ml 3个浓度组，共12组。
        2.2  MC3T3-E1细胞培养及形态学观察将MC3T3-E1细胞培养于100 mm培养皿，含10%胎牛血清，50 mg/l青霉素，30 mg/l链霉素的15 mm α-MEM培养基中，细胞浓度为5×105细胞/皿，置37℃，5%二氧化碳培养箱中进行培养，每隔48h进行一次传代培养。将MC3T3-E1细胞接种于24孔培养板上，每个孔加入含10%胎牛血清的α-MEM培养基400 μl，细胞浓度为8×103 /孔。待48 h后，倒置显微镜下观察细胞形态变化。
        2.3  4种荨麻属植物的8种不同提取物对MC3T3-E1细胞增殖的影响［8，9］取上述48 h培养后的细胞，用不含血清的α-MEM培养基冲洗细胞，然后加入含1%胎牛血清的α-MEM培养基，加入各浓度的荨麻属植物的8种不同提取物，各组提取物样品最终浓度分别为50，100，200 μg/ml。另设空白对照组（不加提取物样品，只加等量细胞悬液），生长因子 (EGF, 10 ng/ml) 阳性对照组，每组设4个复孔。开始测定增殖率，54 h后用不含血清的α-MEM培养基冲洗细胞，然后加入含有10% 活细胞计数试剂CCK-8的400 μl α-MEM培养基，培养3 h，然后在450 nm波长下测定吸光度。计算平均增殖率。
        2.4  荨麻属植物对MC3T3-E1细胞内碱性磷酸酶活性的影响［8，9］上述实验结果表明，三角叶荨麻根的醇提物，宽叶荨麻全草的醇提物和醇提物水层过D101大孔树脂40%洗脱部分能够显著促进MC3T3-E1细胞增殖，取经上述3种提取物不同浓度样品处理的MC3T3-E1细胞，用含有1 mM MgCl2的0.2% 诺乃洗涤剂 (Nonidet P-40) 振摇溶解30 min。设正常对照组和前列腺素E2 (PGE2, 10 ng/ml) 阳性对照组。细胞的溶解产物用来分析碱性磷酸酶的活性。以对硝基磷酸苯酯 (p-nitrophenylphosphate, PNPP) 为底物，分光光度法测定碱性磷酸酯酶(ALP) 的活性。反应混合物中含有1 μmol PNPP，25 μl 细胞溶解产物，反应混合物在37℃ 下培养30 min。在405 nm下测定反应生成的对硝基酚的吸光度。细胞溶解产物的蛋白含量用Bio-Rad蛋白分析试剂测定。
        2.5  统计学分析使用成对t检验对实验数据进行分析，进行组间t检验，P<0.05即认为具有显著性差异。
        3  结果
        3.1  4种荨麻属植物的8种不同提取物不同浓度下对成骨样细胞MC3T3-E1增殖的影响培养基中加入4种荨麻属植物的8种不同提取物后，与对照组相比，三角叶荨麻根的醇提物，宽叶荨麻全草的醇提物和醇提物水层过D101大孔树脂40%洗脱部分，在50到200 μg/ml 的浓度下细胞数量明显增多。正常对照组细胞增殖缓慢。经活细胞计数试剂检测，相对于对照组，三角叶荨麻根的醇提物，宽叶荨麻全草的醇提物和醇提物水层过D101大孔树脂40%洗脱部分能显著促进成骨样细胞MC3T3-E1增殖，在200 μg/ml 的浓度下对成骨样细胞MC3T3-E1的增殖率分别为116.8%，110.5%，116.4%。结果见表1。
        3.2  荨麻属植物对MC3T3-E1细胞内碱性磷酸酶活性的影响用对MC3T3-E1细胞增殖有显著作用的样品三角叶荨麻根的醇提物，宽叶荨麻全草的醇提物和醇提物水层过D101大孔树脂40%洗脱部分，同法处理细胞，以前列腺素E2为阳性对照，经磷酸对硝基苯基质动力学法检测，以细胞的溶解产物中每毫克蛋白中含有碱性磷酸酶的单位数表示细胞内碱性磷酸酶的活性。与对照组相比三角叶荨麻根的醇提物，宽叶荨麻全草的醇提物和醇提物水层过D101大孔树脂40%洗脱部分，在50 μg/ml 到200 μg/ml 的浓度下，细胞内碱性磷酸酶活性有增强的趋势，但无统计学差异。结果见表2。表1  4种荨麻属植物对成骨样细胞MC3T3-E1增殖的影响表2  荨麻属植物对MC3T3-E1细胞内碱性磷酸酶活性的影响
        4  讨论
        成骨样细胞MC3T3-E1具有正常成骨细胞的许多表型特征，经常被用于替代成骨细胞进行实验研究，其增殖在某种程度上可反映成骨细胞的增殖。成骨细胞的增殖有利于骨形成。碱性磷酸酶是成骨细胞分化的一个早期指标，可识别及评价成骨细胞的分化程度，其表达随着细胞分化的发展而增强，是骨形成所必需的酶。碱性磷酸酶可分解有机磷酸释放无机磷，增加局部无机磷酸的浓度，促进矿化，其活性升高可为细胞间质含量改变做好准备，并且是启动矿化的必备条件。本实验结果表明，三角叶荨麻根的醇提物、宽叶荨麻全草的醇提物和醇提物水层过D101大孔树脂40%洗脱部分能明显促进MC3T3-E1细胞的增殖，且具有剂量依赖关系，提示其可能具有直接促进成骨细胞增殖的作用。本实验还显示，三角叶荨麻根的醇提物，宽叶荨麻全草的醇提物和醇提物水层过D101大孔树脂40%洗脱部分可剂量依赖地刺激MC3T3-E1细胞的碱性磷酸酶活性，表明3种提取物所含的成分可能对成骨细胞的分化也具有促进作用，因此提示其在体内可能促进骨形成过程，其对骨形成的确切作用机制尚有待进一步研究。
       【参考文献】
         ［1］ Sambrook P, Cooper C. Osteoporosis［J］.Lancet, 2006, 367 (17): 2010.
       
       ［2］ Manolagas SC, Jilka RL. Bone marrow, cytokines, and bone remodeling: emerging insights into the pathophysiology of osteoporosis［J］.N. Engl. J. Med., 1995, 332 (5): 305.
       
       ［3］ Ducy P, Schinke T, Karsenty G. The Osteoblast: A Sophisticated Fibroblast under Central Surveillance［J］.Science, 2000, 289 (1 Sep): 1501.
       
       ［4］ Meng FH, Li YB, Xiong ZL, et al. Osteoblastic proliferative activity of Epimedium brevicornum Maxim［J］.Phytomedicine, 2005, 12 (3): 189.
       
       ［5］ Suh SJ, Yun WS, Kim KS, et al. Stimulative effects of Ulmus davidiana Planch (Ulmaceae) on osteoblastic MC3T3-E1 cells［J］.Journal of Ethnopharmacology, 2007, 109 (3): 480.
       
       ［6］ 王永奇，冯宝民，李 帆，等.荨麻属植物治疗BPH研究概况［J］.大连大学学报，2005，26（2）：54.
       
       ［7］ 王梦月，卫莹芳，史 炎，等.三种活麻水煎液药理作用探索［J］.时珍国医国药，2001, 12 (8): 673.
       
       ［8］ Kumegawa M, Hiramatsu M, Hatakeyama K, et al. Effects of Epidermal Growth Factor on Osteoblastic Cells in Vitro［J］.Calcified Tissue International, 1983, 35：542.
       
       ［9］ Kumegawa M, Ikeda E, Tanaka S, et al. The Effects of Prostaglandin E2, Parathyroid Hormone, 1,25-Dihydroxycholecalciferol, and Cyclic Nucleotide Analogs on Alkaline Phosphatase Activity in Osteoblastic Cells［J］.Calcified Tissue International, 1984, 36：72.