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       【摘要】 
       目的建立肾石通颗粒的质量标准。方法采用TLC法对处方中延胡索、丹参、王不留行、牛膝进行定性鉴别；采用HPLC法测定制剂中原儿茶醛的含量。结果TLC法可检出延胡索、丹参、王不留行、牛膝的特征斑点；原儿茶醛的线性范围为0.014 3～3.664 0μg（r=0.999 9），平均回收率98.27%（RSD=2.6%，n=5）。结论该方法简便可靠，专属性强，重现性好，可用作肾石通颗粒的质量控制。
       【关键词】  肾石通颗粒； 薄层鉴别； 原儿茶醛； 高效液相色谱法
       Study on the Quality Standard of Shenshitong Granule
        WENG Daiqun, YANG Yong,WANG Tingting, QIN Yao, GAO Taiping, LUO Weizao*
        （Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, Chongqing 400065， China）
        Abstract：ObjectiveTo establish the quality standard of Shengshitong granule. MethodsCorydalis yanghusuo, Salviae miltiorrhiza, vaccaria segetalis and Achyranthes bidentata were identified by TLC, and the content of protocatechuis aldehyde in the preparation was determined by HPLC. ResultsCorydalis yanghusuo, Salviae miltiorrhiza, Vaccaria segetalis and Achyranthes bidentata could be identified by TLC. The linear range of protocatchuis aldehyde was 0.0143～3.6640μg (r=0.9999), and the average recovery was 98.27% (RSD=2.6%, n=5). ConclusionThe method is specific and repeatable, and can be used for the quality control of Shengshitong granule.
        Key words：Shenshitong granule;  TLC;  Prolocatchuis aldehyde;  HPLC
        肾石通颗粒是由金钱草、王不留行、萹蓄、延胡索等10味中药组成的复方制剂。具有清热利湿、活血止痛、化石、排石的作用，主要用于肾结石、肾盂结石、膀胱结石、输尿管结石等症。肾石通颗粒原标准无鉴别和含量测定项，其质量控制无法满足现代药物制剂的要求。为了有效控制产品质量，保证用药的安全和有效，本研究采用TLC法对处方中延胡索、丹参、王不留行、牛膝进行定性鉴别，用HPLC法［1］测定作为有效成分之一的原儿茶醛的含量。
        1  仪器与试药
        1.1  仪器WatersTM2695-2996（美国）高效液相色谱仪：包括2695型泵，2996型二极管阵列检测器，自动进样器，EmpowerTM数据处理软件；岛津AEG-45SM电子天平（日本）。
        1.2  试药原儿茶醛对照品（中国药品生物制品鉴定所提供，供含量测定用，批号0810-00004）；肾石通颗粒（重庆太极集团桐君阁药厂提供）；甲醇为色谱纯试剂，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。
        2   方法与结果
        2.1   定性鉴别
        2.1.1    延胡索薄层鉴别［2］取本品30 g，研细，加乙醇140 ml超声提取两次，滤过，合并滤液并蒸干，残渣加水溶解，用氯仿80 ml提取两次，合并氯仿液，氯仿层蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为延胡索供试品溶液；取缺延胡索的阴性样品同法制成缺延胡索的阴性对照液；取延胡索对照药材3 g同法制成延胡索药材对照液；另称取延胡索乙素对照品适量，加甲醇制成每毫升含0.3 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取供试品溶液10 μl，阴性对照液10 μl，药材对照液10 μl，对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-氯仿-甲醇（7.5∶4∶1）为展开剂，预先饱和30 min， 在室温下展开，取出，晾干。用碘熏20 min，取出，挥尽板上附着的碘，置紫外光灯（254 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照无干扰。见图1。
        2.1.2   丹参的薄层鉴别取“2.1.1”中氯仿萃取后的水层再用醋酸乙酯80 ml提取2次，合并醋酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为丹参供试品溶液；取缺丹参的阴性样品同法制成缺丹参的阴性对照液；取丹参对照药材0.5 g同法制成丹参药材对照液；另称取原儿茶醛对照品适量，加甲醇制成每毫升含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述4种溶液各5～10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-丙酮-甲醇-甲酸（10∶2∶1∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%三氯化铁溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照无干扰。见图2。
        2.1.3  王不留行的薄层鉴别［2］取“2.1.2”中醋酸乙酯萃取后的水层再用水饱和的正丁醇80 ml提取2次，合并正丁醇提取液，蒸干，残渣加水适量使溶解，上D101大孔树脂柱（D101型，柱长8 cm，内径1 cm），用水洗至洗脱液无色，再用30%乙醇60 ml洗脱，收集乙醇洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1 ml溶解，作为王不留行供试品溶液；取缺王不留行的阴性样品同法制成缺王不留行的阴性对照液；另称取王不留行对照药材粉末0.5 g，加乙醇30 ml超声提取两次，20 min/次，滤过，合并滤液并蒸干，残渣加水15 ml使溶解，用醋酸乙酯30 ml提取2次，弃去醋酸乙酯层，水层再以水饱和的正丁醇40 ml提取2次，合并正丁醇提取液，蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为王不留行对照药材溶液；同法制成王不留行药材溶液。吸取上述 4 种溶液各5～10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以水饱和正丁醇-醋酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%香草醛的乙醇制硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照无干扰。见图3。
        2.1.4    牛膝的薄层鉴别［2］取本品30g，研细，加乙醇140 ml超声提取两次，20 min/次，滤过，合并滤液并浓缩至约20 ml，加盐酸2 ml，沸水浴中回流1h，浓缩至约8 ml，加水15 ml，用石油醚（60～90℃）共50 ml提取2次，合并石油醚液，蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为供试品溶液；取牛膝对照药材同法制成药材对照液；缺牛膝的阴性对照液同法制成缺牛膝的阴性对照液；另称取齐墩果酸对照品适量，加甲醇制成每毫升含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述 4 种溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-甲醇（30∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同的斑点。阴性对照无干扰。见图4。
        2.2   含量测定 
        2.2.1   色谱条件与系统适应性色谱柱为Dikma Diamonsil C18（4.6mm×150 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.05%磷酸溶液（15∶85）；流速为1.0 ml/min；检测波长280 nm；柱温30℃。理论板数按原儿茶醛峰计算应不低于3 000。
        2.2.2   对照品溶液的制备  精密称取原儿茶醛对照品适量，加甲醇制成每毫升含4 μg的溶液，摇匀，即得。
        2.2.3   供试品溶液的制备  取本品颗粒约3.0 g，精密称定，置锥形瓶中，加入70%乙醇超声提取3次，30 ml/次，30 min，离心，合并上清液，水浴浓缩，残渣用甲醇-水（15∶85）溶解并定容于25 ml量瓶，摇匀，取上清液，用0.45 μm滤膜滤过，作为供试品溶液。
        2.2.4   系统适用性实验  分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各20 μl注入高效液相色谱仪，色谱图见图5～7。原儿茶醛保留时间约为17.5 min，与其他组分分离良好(R>1.5)，阴性对照色谱图在原儿茶醛峰位置无干扰。
        2.2.5  线性关系考察精密称取原儿茶醛对照品4.58 mg置25 ml容量瓶中，用甲醇溶解，定容。配制成浓度为0.716，2.863，11.450，45.800，183.200 μg/ml的对照品溶液，精密吸取上述各对照品溶液20 μl，依选定的色谱条件进行测定，以原儿茶醛的浓度为横坐标，其峰面积积分值为纵坐标，进行线性回归，计算回归方程为：Y＝1.29×108X+6180（r＝0.999 9），表明原儿茶醛在0.014 3～3.664 0 μg范围内有良好的线性关系。
        图5  对照品色谱图      图6  供试品色谱图      图7  缺丹参阴性色谱图
        2.2.6   精密度实验  精密吸取同一对照品溶液，重复进样测定6次，20μl/次，测定原儿茶醛峰面积积分值，结果RSD为0.30％(n=6)。
        2.2.7   稳定性实验  取同一供试品溶液，分别于0，2，4，6，8h各进样1次，测定原儿茶醛峰面积积分值，结果RSD为0.66％，表明供试品溶液在8 h内稳定。
        2.2.8   重复性实验  取同一批号样品（批号040501）粉末5份，精密称定，照“2.2.3”中方法制备，分别测定样品中原儿茶醛的含量，结果RSD为2.80％。表明重现性较好。
        2.2.9   回收率实验  精密称取已知含量的本品（批号040501）粉末5份，分别精密加入浓度为26 μg/ml的对照品溶液2.0 ml，照“2.2.3”中方法制备5份供试品溶液，测定原儿茶醛含量，计算回收率。回收率测定结果见表1。结果表明本品具有良好的回收率。表1  加样回收实验结果
        2.3   样品含量测定  按“2.2.3”项下方法制备 3 批中试样品，分别注入液相色谱仪，测定样品中原儿茶醛的含量。 3 批样品结果见表2。 表2  3批样品结果
           3  讨论
        3.1   薄层鉴别王不留行的薄层鉴别主要针对其中的生物碱类［3］与皂苷类成分，研究中发现很难鉴别出生物碱类成分，因此采用王不留行对照药材为对照，来鉴别皂苷类成分；延胡索以延胡索乙素为对照品进行鉴别，专属性好；丹参以其中的水溶性成分原儿茶醛为鉴别指标，专属性好；对牛膝的鉴别采用将其中的三萜皂苷水解成齐墩果酸后，以齐墩果酸对照品为指标进行鉴别，专属性好。因此薄层鉴别最终采用对王不留行、延胡索、丹参、牛膝进行鉴别。
        3.2   含量测定本实验对样品中原儿茶醛的提取方法进行了摸索，分别考察了不同浓度的乙醇和提取次数对原儿茶醛含量的影响。最后确定了提取条件为70%乙醇提取 3 次。
        肾石通颗粒的原标准无薄层鉴别和含量测定，其质量控制无法满足现代药物制剂的要求，本文采用了薄层色谱法对方中王不留行等四味药进行薄层鉴别，HPLC 法对丹参中原儿茶醛进行含量测定，结果准确可靠，操作简便，提高了药物制剂的质量标准，增强了药品质量的可控性，符合中药现代化的要求，可用于该制剂的质量控制与评价。
       【参考文献】
         ［1］ 葛建华，龚旭东，窦志华，等.高效液相色谱法测定丹参口服液中原儿茶醛的含量［J］．时珍国医国药, 2004,15（5）:266.
       
       ［2］ 国家药典委员会.中国药典,Ⅰ部 ［S］.北京:化学工业出版社,2005:49.
       
       ［3］ 鲁 静.中药王不留行中刺桐碱和肥皂草苷分离鉴定和测定［J］.研究简报，1998,18（3）:163.