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       【摘要】 
       目的探讨益气养阴散结方含药血清对人肺癌Ａ５４９ 细胞凋亡及生存素（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）基因表达的影响。方法根据实验动物学原理制备大鼠含药血清和正常血清，设含药血清组和空白血清组，应用Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ／ＰＩ 染色法检测益气养阴散结方含药血清对人肺癌Ａ５４９ 细胞凋亡率的影响，观察凋亡细胞形态学变化，并用逆转录ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ －ＰＣＲ，ＲＴ －ＰＣＲ）法检测其对Ｓｕｒｖｉｎｉｎ 基因表达的影响。结果与对照组比较，药物组Ａ５４９ 细胞的凋亡率显著增高（P＜０．０１），Ｓｕｒｖｉｎｉｎ ｍＲＮＡ 的表达显著下降（P＜０．０５）。结论益气养阴散结方含药血清能明显促进Ａ５４９ 细胞的凋亡，下调凋亡相关基因Ｓｕｒｖｉｎｉｎ 的表达。
       【关键词】  益气养阴散结方 肺肿瘤 细胞凋亡 生存素
       Research on the Effect of Yiqi Yangyin Sanjie Prescription on the Apotosis and Expression of Survivin of A５４９ Cells
       XＵ Ｌａｎｇ， ＬＩ Ｙｕｈｏｎｇ， ＣＨＥＮＧ Ｚｈａｏｚｈｉ
       （School of Medicine， Wuhan University of Science and Technology， Wuhan ４３００６５， China； Hubei Traditional Chinese Medical University， Wuhan ４３００８０， China）
       Abstract：ObjectiveＴｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｙｉｑｉ Ｙａｎｇｙｉｎ Ｓａｎｊｉｅ Ｐｒｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ （ａｂｂｒｅｖｉａｔｅｄ ａｓ ＹＹＳＰ）（ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｉｎ ｓｅｒｕｍ） ｏｎ ａｐｏｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｓｕｒｖｉｖｉｎ ｏｆ Ａ５４９ ｃｅｌｌｓ．MethodsＹＹＳＰ waｓ administrated ｇａｓｔｒｉｃ ｇａｖａｇｅ ｔｏ ｎｏrｍａｌ ｒａｔｓ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＹＹＳＰ， ｗｈｉｃｈ waｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｇｒｏｕｐ ｗｉｔｈ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｔｈｅ ｒａｔ ｓｅｒｕｍ ｗｉｔｈｏｕｔ ＹＹＳＰ waｓ ｔａｋｅｎ ａｓ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＹＹＳＰ ｏｎ ｔｈｅ ａｐｏｔｏｓｉｓ ｏｆ Ａ５４９ ｃｅｌｌｓ waｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ ／ＰＩ； ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｔ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｕｒｖｉｖｉｎ ｍＲＮＡ waｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＲＴ －ＰＣＲ.ResultsＣｏｍｐａｒed ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ， ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ａｐｏｔｏｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｒｏｕｐ ｗｉｔｈ ｍｅｄｉｃｉｎｅ increased ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（P ＜０．０１），ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｕｒｖｉｖｉｎ ｍＲＮＡ decreased ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（P ＜０．０５）．ConclusionＳｅｒｕｍ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＹＹＳＰ ｃａｎ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｉｎｄｕｃｅ ａｐｏｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖｉｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａ ５４９ ｃｅｌｌｓ．
       Key words：Ｙｉｑｉ Ｙａｎｇｙｉｎ Ｓａｎｊｉｅ Ｐｒｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ；  Lｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ；  Ａｐｏｔｏｓｉｓ；  Ｓｕｒｖｉｖｉｎ
       
       原发性支气管肺癌是指原发于支气管黏膜和肺泡的癌症，是最常见的恶性肿瘤之一，预计到２０２５ 年，每年将有９０ 万人死于肺癌，中国将成为肺癌患病率第一大国［１］ 。近年来，中药在肿瘤临床治疗中的作用引起了医学界的瞩目，合理开发和运用中医药的抗肿瘤作用成为研究的热点。
       
       益气养阴散结方是笔者导师湖北中医学院成肇智教授治疗肺癌的临床验方。为了进一步揭示其抗肿瘤的具体机制，本实验采用血清药理学方法，从细胞水平探讨益气养阴散结方对人肺癌Ａ５４９ 细胞凋亡及相关基因生存素（Ｓｕｒｖｉvｉｎ）表达的影响。
       １  　材料与方法
       １．１  　细胞与细胞培养人肺癌Ａ５４９ 细胞由武汉大学生命科学院惠赠。接种于ＲＰＭＩ １６４０ 完全培养液（含１０％胎牛血清，１００Ｕ／ｍｌ 青霉素，１００Ｕ／ｍｌ 链霉素）中，５％ＣＯ２，３７℃温箱中培养，２ ～３ ｄ 更换一次培养液，细胞长满后０．２５％胰酶消化、传代。
       １．２  　含药血清的制备益气养阴散结方由生黄芪、南沙参、莪术等组成，均购自湖北中医学院附属医院门诊部，传统方法煎制，浓缩为１ ｍｇ／ｍｌ。根据实验动物学原理以１０ ｍｌ／ｋｇ 给大鼠灌胃，２次／ｄ，连续３ ｄ，于末次给药后１ ｈ，经右心室取血，通过离心取得含药血清［２］ ；同样的方法生理盐水灌胃后取得空白血清，均置于－２０℃保存备用。
       １．３  试剂胎牛血清、ＲＰＭＩ １６４０ 培养液购自ＧＩＢＣＯ 公司； Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ／ＰＩ 凋亡检测试剂盒购自Ｒ＆Ｄ 公司；ＲＴ －ＰＣＲ 法所需试剂由Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公司提供；引物由上海生物工程技术有限公司合成。
       １．４  仪器恒温二氧化碳培养箱（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｏｒｍａ 公司）； ＥＰＩＣＳ －ＸＬ 型流式细胞仪（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ 公司）；荧光显微镜（日本Ｐｌｙｍｐｕｓ 公司）；Ｈ －３００ 透射电镜（日本日立公司）；基因扩增仪（Ｂｉｏｍｅｔｒａ 公司）；全自动图象分析仪（武汉同济千屏影像工程公司）。
       １．５  方法
       １．５．１  细胞的药物干预与处理将细胞接种于２４ 孔培养板中（均设６ 个复孔），每孔的细胞浓度为１ ×１０５ ／ｍｌ，继续培养至细胞长满单层后，弃培养液，加入含药血清及空白血清，分别设为药物组和对照组。继续培养４８ ｈ 后，用０．２５％胰蛋白酶消化收集细胞以进行实验。
       １．５．２  荧光显微镜观察收集细胞制备细胞悬液，浓度为１ ×１０６ ／ｍｌ，取９５ μｌ 的吖啶橙贮存液混匀，吸一滴混合液点于洁净玻片上，直接用盖玻片封片，荧光显微镜观察。
       １．５．３  透射电镜观察收集细胞，４％戊二醛固定２ ｈ，０．１ ｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液漂洗，１％四氧化锇固定。梯度酒精脱水，Ｅｐｏｎ －８１２包埋，ＬＫＢ －Ｖ 超薄切片机切薄片，醋酸钠和柠檬酸铅染色，Ｈ －３００ 透射电镜观察。
       １．５．４  Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ／ＰＩ 法检测细胞凋亡按照Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ／ＰＩ 凋亡检测试剂盒说明操作，上流式细胞仪检测。
       １．５．５  ＲＴ －ＰＣＲ 法检测Ｓｕｒｖｉｖｉｎ 的表达①ＲＮＡ 提取和ｃＤＮＡ合成：用Ｔｒｉｚｏｌ 试剂提取总ＲＮＡ，用反转录试剂提供的标准条件进行反转录反应，所获取的ｃＤＮＡ 作为ＰＣＲ 反应模板。②扩增ＳｕｒｖｉｖｉｎｍＲＮＡ，引物序列为上游：５’ －ＧＣＡＴＧＧＧＴＧＣＣＣＣＧＡＣＧＴＴＧ －３’， 下游：５’ －ＧＣＴＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＧＣＣＴＣＡＡ －３’。内参照采用ｈｐｒｔ，引物序列为上游：５’ －ＣＣＴＧＣＴＧＧＡＴＴＡＣＡＴＴＡＡＡＧＣＡＣＴ －３’， 下游：５’ －ＧＴＣＡＡＧＧＧＣＡＴＡＴＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡ －３’③ＰＣＲ 反应体系为２５ μｌ。条件：９４℃ ３ ｍｉｎ 预变性后开始循环，９４℃变性３０ ｓ，５２℃复性３０ ｓ， ７２℃延伸１ ｍｉｎ， 共３５ 个循环，最后于７２℃延伸７ ｍｉｎ，扩增产物为４４７ ｂｐ。④取５ μｌ ＰＣＲ 产物和内参照ｈｐｒｔ 的ＰＣＲ 产物在１％的琼脂糖凝胶上电泳，ＥＢ 染色，用电泳凝胶成像自动分析系统进行半定量分析。
       １．６  数据处理数据以（±s）表示，均用ＳＰＳＳ１２．０ 软件处理。
       ２  　结果
       ２．１  荧光显微镜观察结果凋亡细胞的细胞核及细胞质内可见致密浓染的黄绿色染色，少量黄绿色碎片，而坏死细胞的细胞质内黄绿色或橘黄色荧光均减弱或消失。
       ２．２  透射电镜观察结果凋亡细胞染色质固缩，多聚集于核膜内侧，呈境界分明块状或月行小体，细胞浆浓缩，内可见完整的细胞器。
       ２．３  Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ／ＰＩ 法检测结果见图１，ＵＬ 区为细胞坏死，ＬＬ 区为细胞存活，ＬＲ 区早期凋亡，ＵＲ 区为晚期凋亡，凋亡总计＝ＬＲ区＋ＵＲ 区。含药血清处理后，细胞凋亡增多（见表１），凋亡率明显高于空白血清组（P ＜０．０５）。
       图1  含药血清诱导细胞凋亡的流式细胞仪结果（略）
       表1  含药血清诱导细胞凋亡的结果（略）
       与空白血清组比较，*P<0.05，n=6
       ２．４  　ＲＴ －ＰＣＲ 法检测结果在紫外透视仪下初步观察条带（见图２），可见空白血清组所得条带亮度明显强于含药血清组，说明经药物干预后，肺癌细胞内的Ｓｕｒｖｉｖｉｎ ｍＲＮＡ 的表达受到了抑制。经过电泳凝胶成像自动分析系统半定量分析（见表２）和统计学处理，含药血清组Ｓｕｒｖｉｖｉｎ ｍＲＮＡ 的表达明显低于空白血清组，其差异具有显著性（P ＜０．０５）。
       图2  Survivin mRNA电泳图表2  各组Survivin mRNA相对表达含量（略）
       与空白血清组比较，*P<0.05；n=4
       3  讨论
          
       中医学研究认为气阴两虚是肺癌最基本的病机特征，并贯穿于肺癌发病的始终，因此临床治疗多以益气养阴为主，并取得了一定疗效［３，４］ 。而笔者导师成肇智教授认为，肺癌的发生多是在气阴两虚的基础上六淫等邪乘虚侵肺，热毒痰淤胶结，逐渐形成肺部肿块。因此，选用益气养阴散结法更切合病机。根据这一思路确定的益气养阴散结方在临床工作中取得了很好的效果。本方是由生黄芪、南沙参、莪术等组成，方中莪术行气破血消积，生黄芪补气升阳，调节机体免疫能力，同时又可防莪术耗气伤气之弊，沙参润肺滋阴，沙参之寒与黄芪之温相配，则寒而无伤脾之虞，燥而无劫阴之虑。诸药配伍，攻补兼施，共奏益气消淤、扶正祛邪之功。随着中医学与现代科技的逐渐结合，如何从分子水平阐明其抗肿瘤的具体机制正成为研究的需要。
       
       细胞凋亡是由基因控制的细胞的自我消亡，近年来的研究发现，细胞凋亡在许多疾病的发生，尤其是在肿瘤的发生、发展和转归中起重要作用。凋亡受抑、细胞死亡不足是肿瘤发病的重要途径之一，如果病变组织内肿瘤细胞存活延长，使细胞群体内存活与死亡的平衡被破坏，存活大于死亡，则肿瘤细胞数目净增多。因而，从发病学角度来看，细胞凋亡实际上是机体天然的抗癌机制之一。研究表明，许多抗癌药物正是通过诱导增强细胞的凋亡实现其抗肿瘤的作用［５，６］ 。
       
       细胞的凋亡过程受到很多基因的调控，具体机制也十分复杂，现有研究表明［７］ ，Ｓｕｒｖｉｖｉｎ 是迄今为止发现的最强的凋亡抑制因子，可全面抑制Ｆａｓ、ｃａｓｐａｓｅ、ｂａｘ、某些化疗药物、ＴＮＦ、Ｘ 射线等多种凋亡刺激因子的作用。其作用可能的途径有两条，一是直接或间接抑制ｃａｓｐａｓｅｓ 的活性，另一条是与纺锤体的微管蛋白特异性结合，促进细胞分裂，抑制凋亡。
       
       本研究结果证明，益气养阴散结方能有效促进肺癌细胞的凋亡和降低Ｓｕｒｖｉｖｉｎ ｍＲＮＡ 的表达，可能的机制是益气养阴散结方能有效下调Ｓｕｒｖｉｖｉｎ 编码的ｍＲＮＡ 在肺癌细胞中的表达，导致Ｓｕｒｖｉｖｉｎ 蛋白的表达继发下调，削弱甚至解除对ｃａｓｐａｓｅｓ 的抑制作用，同时解除与纺锤体的微管蛋白特异性结合，促进细胞分化，从而实现诱导凋亡的作用。虽然其具体的机理还有待研究，但中药在抗肿瘤方面的广阔前景无疑是令人期待的。
       【参考文献】
         　　［1］ 元风丽．吸烟致肺癌分子机制的研究进展［Ｊ］．预防医学情报杂志，２００４，２０（３）：２７０．　
       
       ［2］ 袁冬生，王新华，李常青，等．复方肝癌宁含药血清诱导肝癌细胞凋亡的实验研究［Ｊ］．世界华人消化杂志，２００６，１４（５）：５２２．
       
       ［3］ 柯立霞，宋爱英．益气养阴法联合化疗治疗中晚期肺癌３２ 例［Ｊ］．中西药学报，２００６，３４（３）：４６．
       
       ［4］ 田　静，施志明，吴海良．益气养阴法对中晚期非小细胞肺癌血浆ＣＤ６２ｐ 影响的临床研究［Ｊ］．时珍国医国药，２００６，１７（８）：１５３９．
       
       ［5］ 杨传标，徐克成．中药的抗肿瘤作用［Ｊ］．国际医药卫生导报，２００４，１０（１８）：９．
       
       ［6］ 沈世林，赵健雄，朱玉真，等．复方中药制剂对肿瘤细胞ＮＦ －κＢ 表达及其凋亡影响的实验研究［Ｊ］．四川中医，２００４，２３（７）：１２．
       
       ［7］ 董德琼，薛东鹰，杨渝浩．ｓｕｒｖｉｖｉｎ 蛋白在肺腺癌中的表达和临床意义［Ｊ］．国际呼吸杂志，２００６，２６（２）：９２．