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       【摘要】 
       目的在分子水平上探讨大蓟总黄酮的抗肿瘤机制，主要研究大蓟总黄酮对荷瘤小鼠白介素1（IL1）和白介素2（IL2）的影响。方法通过RT-PCR方法半定量检测肿瘤小鼠细胞产生IL1 mRNA和IL2 mRNA的量来研究大蓟总黄酮能否促进肿瘤小鼠细胞产生IL1 mRNA和IL2 mRNA。结果大蓟总黄酮能够极为显著地提高肿瘤小鼠细胞产生IL1和IL2的转录水平（P<0.01）。结论 大蓟总黄酮能明显地促进肿瘤小鼠IL1和IL2 mRNA的表达。
       【关键词】  大蓟总黄酮 白细胞介素 1 白细胞介素 2
       The Effects of the Total Flavones on IL-1 and IL-2 in the Tumor-bearing Mice
       LIU Sujun,  ZHOU Zebin1,HU Xia，ZHANG Jie
       1. Leshan Normal College, Leshan,Sichuan 614004;
       2. Sichuan vnirersity, Chengdu 610064, China;
       3. Sichucan Rural Science and Technologg Development Center 610101, Chengdu China
       Abstract:ObjectiveIn order to further exploit the anti-tumor mechanism of total flavones in Cirsium japonicum DC at molecular level, the effects of the total flavones on the interleukin 1（IL1） and interleukin 2（IL2） in the tumor-bearing mice were studied. MethodsThe IL1mRNA and IL-2mRNA detected in the spleen cells and abdominal cells of the tumor-bearing mice by highly sensitive RT-PCR technology. ResultsThe total flavones in Cirsium japonicum DC could enhance the expression of IL1 and IL2 mRNA（P<0.01）.ConclusionThis study suggested that the total flavones in Cirsium japonicum DC can enhance the expression of IL1 and IL2 mRNA.
       Key words:The total flavones in Cirsium japonicum DC；  IL1；  IL2
       大蓟为菊科管状花亚科菜蓟族蓟属植物Cirsium jiaponicum DC.的干燥地上部分或根［1］，我国各地均产。大蓟性凉，味甘、苦，归心、肝经，功效为凉血止血、祛淤止痛。大蓟的主要成分为黄酮类化合物，文献报道其多聚乙炔具有抗肿瘤作用［2］。其总黄酮在体内有抗肿瘤作用并能提高肿瘤小鼠的免疫功能［3］。
         
       细胞因子是具有免疫调节作用的一类重要蛋白质物质。许多中药可以通过激活单核巨噬细胞系统，诱生多种细胞因子(如促进干扰素生成，促进白细胞介素生成，诱生肿瘤坏死因子等)来增强动物免疫功能。白细胞介素(IL)能活化B细胞、巨噬细胞、NK细胞,近年来研究发现许多中药都有促进细胞因子产生的作用。例如枸杞子能促进老年小鼠产生IL-2；中华猕猴桃提取物能使小鼠脾细胞培养上清液中IL-2活性明显升高；黄芪多糖能使大黄脾虚模型小鼠低下的IL-2活性升高，而对正常小鼠无影响；青蒿素抑制IL-2的产生；银耳多糖高浓度时则降低小鼠脾细胞培养液中的IL-2的活性［4］。一般来说，细胞中某种mRNA的数量是其编码基因活性的直接反映。所以某种mRNA的定量是随着在不同的时空状态下编码基因表达活性的变化而有所不同。RTPCR具有很高的敏感性［5，6］，可以用来分析不同的组织、或相同组织不同发育阶段中mRNA表达状况的相关性。
       1  器材与方法
       1.1  供试动物
       昆明种标准小鼠，体重（21±2）g，雌雄各半，由四川中药研究所提供BalB/C纯种小鼠，体重（20±2）g，雌雄各半，由成都中医药大学动物中心提供C57BL/6J纯种小鼠，体重（20±2）g，雌雄各半，由成都中医药大学动物中心提供。
       1.2 大蓟总黄酮的制备 
       将大蓟70%乙醇提取物与硅藻土拌样挥干后,装入玻璃管柱中，用石油醚流洗,去除其中的叶绿素和极性较小的成分；流洗结束后倒出硅藻土化合物，挥干溶剂重新装入玻璃管柱，正丁醇流洗提取，用1%三氯化铝乙醇溶液与黄酮类化合物在滤纸上显色后，在紫外灯下观察有无黄绿色荧光的方法检测监控，提取至流洗液无黄酮反应时结束；将正丁醇提取液浓缩后挥干溶剂，用少量95%的乙醇溶解后上聚酰胺树脂柱，依次用水和95%的乙醇洗脱，收集95%的乙醇洗脱液；洗脱至检测无黄酮反应时结束；浓缩95%的乙醇洗脱液，自然干燥，挥干溶剂后得到的成分即为总黄酮成分。紫外分光光度测定其总黄酮含量为98.52%。
       1.3  试剂RPMI
       1640（GIBCO公司）；胎牛血清（HyClone公司）；小牛血清（HyClone公司）；Heper"s（HyClone公司）；台肦蓝，MTT，LPS，SDS，ConA，琼脂糖均为Sigma公司；RPMI1640培养液；谷氨酰胺，青霉素，庆大霉素，Tris Base，a甲基甘露糖苷（amm）。
       1.4 仪器
       酶标仪（Bio-Rad，Model 3550）；离心机（北京医用离心机厂，LDZ52）；倒置显微镜（Nikon DEAPHOT Fx35DX）；二氧化碳细胞培养箱（BNA311，ESPEC）；电子恒温水浴锅（DK98I）；微量高速离心机（Jouan）；三恒电泳仪（ECP3000，北京市六一仪器厂）。
       2  方法
       2.1  造模方法昆明种小鼠，40只，体重18～22g，雌雄各半，随机分为空白组、模型组、大蓟黄酮＋模型组。空白组和模型组用生理盐水0.2 ml/10 g体重灌胃，大蓟总黄酮＋模型组用大蓟总黄酮0.2 ml/10 g体重灌胃，剂量为50 mg/kg，1次/d，连续10 d。第8天模型组和大蓟黄酮＋模型组腹腔注射环磷酰胺55 mg/kg，0.1 ml/10 g，连续3 d。
       2.2  大蓟黄酮对小鼠腹腔巨噬细胞产生IL-1的影响
       2.2.1  IL1样品的制备供试小鼠以颈椎脱臼法处死，75%乙醇浸泡5 min，用预冷的DHank"s液5 ml注射入小鼠腹腔，轻揉数10次，充分洗出腹腔细胞，2 000 r/min离心10 min，用RPMI-1640培养液洗涤两次，用含5%小牛血清的RPMI1640调细胞数至2×106/ml加入24孔细胞培养板中贴壁2 h。弃上清液，洗涤细胞，去除非粘附性细胞。加入10 μg/ml的LPS和含10%小牛血清的RPMI-1640培养液，在37℃，5%CO2潮湿大气中温育48h；收集上清液，-20℃保存，即为IL1待测样品，收集细胞，提取RNA。
       2.2.2  IL1样品的检测以C57BL/6J纯种小鼠胸腺细胞作为检测IL1的靶细胞。。供试小鼠以颈椎脱臼法处死，无菌取胸腺，用灭菌玻璃注射器芯挤压过200目钢丝网，2 000 r/min离心10 min，洗涤两次，台肦蓝染色，计活细胞数，用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液调至1×106/ml，将细胞悬液加入96孔细胞培养板，每孔100μl（1×105个细胞）。用RPMI-1640培养液以1/4，1/8，1/32比例稀释IL-1待测样品，每孔加50μl稀释液，每个稀释度设3个复孔。每孔加入亚剂量有丝分裂原ConA至终浓度为2μg/ml。每孔总容量为200 μl。在37℃，5%CO2潮湿大气中培养48 h。用MTT比色法测定结果。
       2.3 大蓟总黄酮对小鼠脾淋巴细胞产生IL2的影响
       2.3.1  IL2样品的制备供试小鼠以颈椎脱臼法处死，75%乙醇浸泡5 min，无菌取脾，用RPMI1640培养液洗涤，在200目钢丝网上剪碎，用灭菌玻璃注射芯轻磨、过滤，分别制成脾细胞悬液，0.83%TrisNH4Cl破坏红细胞，冰浴静置10 min，2 000 r/min离心10 min，用RPMI-1640培养液洗涤细胞两次，经台肦蓝染色测定细胞活率大于95%。再以含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液制成1×107/ml脾淋巴细胞悬液，加Con A5 μg/ml，培养于24孔细胞培养板，在5%CO2潮湿大气中37℃温育24 h；离心收集上清液，-20℃保存，即为IL2待测样品。收集细胞，提取RNA。
       2.3.2  IL2检测细胞的制备BalB/C小鼠以颈椎脱臼法处死，75%乙醇浸泡5 min，无菌取脾，用RPMI-1640培养液洗涤，在200目钢丝网上剪碎，用灭菌玻璃注射芯轻磨、过滤，制成脾细胞悬液，0.83%Tris-NH4Cl破坏红细胞，冰浴静置10 min，2 000 r/min 离心10 min，用RPMI-1640培养液洗涤细胞两次，经台肦蓝染色测定细胞活率大于95%。再以含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液制成5×106/ml脾淋巴细胞悬液，加ConA 2.5 μg/ml，置25 ml的细胞培养瓶中温育96 h。细胞用10 mg/ml a-甲基甘露糖苷（a-mm）的Hank"s液洗两次，含10%胎牛血清的RPMI1640培养液洗1次，调节细胞浓度为 1×106/ml，作为测定IL2的反应靶细胞。
       2.3.3  IL2样品的检测取-20℃保存的各组IL-2上清液，均作1/4，1/8，和1/32稀释，分别用ConA活化的小鼠脾淋巴细胞测定其IL2水平。即在96孔细胞培养板中，每孔加反应细胞0.1 ml（1×105个）和等量稀释后的IL2上清液，每样均设3个复孔。每孔加100 mg/ml的a甲基甘露糖苷（a-mm）20 μl。在37℃，5%CO2潮湿大气中温育48h。用MTT比色法测定结果。
       2.4  MTT法测定细胞数于细胞培养结束前5 h每孔弃去培养上清100 μl，加入浓度为5 mg/ml的MTT 10 μl（用生理盐水配制，过滤除菌）。培养结束后，每孔加10%SDS（用0.01 M的HCl配置）100 μl，振荡混匀，37℃下4 h，用酶标仪在570 nm处读取OD值。
       2.5   RNA提取按试剂盒说明进行操作。
       2.6  引物设计从NCBI获得相关产物的mRNA序列，使用Primer Primier5软件设计引物。
       IL1：为IL-1α链序列。上游：5" TCG TGG AAT GTG GAT GGT 3"，退火温度53.8℃。下游：3" CAA AGA ACA AAG TCG GGT 5"，退火温度50.9℃。产物长度：420 bp。
       
       IL2：上游：5" TGG GAA CGA TTA GTG AGG 3"，退火温度50.6℃。下游：3" AAA GGG CTC TGA CAA CAC 5"，退火温度51.2℃。产物长度：454 bp。
       内标引物βactin：上游：5" GTA AAG ACC TCT ATG CCA ACA 3"，退火温度52.3℃。下游：3" CAC CAA TGT CCT TCA GGG AG 5"，退火温度53.2℃。产物长度：624 bp。
       2.7  RT-PCR按试剂盒说明书操作。
       2.8   统计方法实验所得数据用±s表示，各组数据间的差异用t检验判断其统计学意义。
       3  结果
       3.1  大蓟总黄酮对小鼠腹腔巨噬细胞产生IL－1的影响结果见表1。从表1中可以看出，剂量为100 mg/ml的大蓟总黄酮与模型组相比其腹腔巨噬细胞产生IL1的能力差异极显著。表1  大蓟总黄酮对肿瘤小鼠腹腔巨噬细胞产生IL1的影响（略）
       3.2  大蓟总黄酮对肿瘤小鼠脾淋巴细胞产生IL2的影响
       结果见表2。从表2中可以看出，空白组和模型组小鼠灌胃大蓟黄酮药液后，脾淋巴细胞产生IL2的能力有较大的提高。100 mg/ml实验组与模型组相比差异极显著。表 2  大蓟黄酮对肿瘤小鼠脾淋巴细胞产生IL2的影响（略）
       
       3.3  RNA提取结果分析
       RNA提取结果见图1，从图1可以看到：总RNA在电泳条件下看不见有基因组DNA和蛋白质的污染，23S核糖体RNA与18S核糖体RNA的带型比较清晰，无拖尾现象，两条带的亮度比基本上呈现2∶1的关系，由此说明此RNA完整性比较。
       3.4   对IL1和IL2基因表达的RTPCR分析
       通过目标基因扩增条带亮度与内标基因βactin扩增条带亮度的比值可以了解目标基因表达情况，比值越大则目标基因表达量相对越大，因此通过对该比值的分析可以判断大蓟总黄酮是否可提高小鼠细胞IL1和IL2基因表达水平。细胞IL1和IL2基因表达情况见图2，从图2（A，B）中可以看出，βactin基因扩增产物大小约为650 bp左右，IL-1基因扩增产物大小约为400 bp左右，IL基因扩增产物大小约为450 bp左右，均与引物设计时预期产物大小近似。IL1和IL2基因扩增条带光密度与β-actin基因扩增条带亮度通过syngene软件分析。结果见表3。从表3可以看出，±s检验，IL1和IL2基因与空白组比较差异显著，表明大蓟总黄酮对肿瘤小鼠细胞IL1和IL2基因表达水平有显著提高。表3  目标基因扩增条带与βactin基因扩增条带亮度比值（略）
       4  讨论
       IL-1是由多种细胞产生、有多方面生物学功能的高活性细胞因子，是一种对机体免疫功能有影响的细胞因子。IL－2是15-17.2 kDa的糖蛋白，主要由T细胞（CD4+和CD8+）和大颗粒淋巴细胞（LGL），包括NK细胞和LAK细胞产生的，在抗肿瘤方面有着重要的作用。
       本研究结果证明大蓟总黄酮能够促进肿瘤小鼠细胞中IL-1，IL-2基因的转录作用。这一结果与我们先前得到的大蓟总黄酮能够促进小鼠细胞分泌IL-1和IL-2的结果是一致的。
       分别提取给药组和空白组小鼠的总RNA，通过RT-PCR方法半定量检测大蓟总黄酮对IL-1 mRNA和IL-2 mRNA生成的影响。研究发现，总RNA在电泳条件下看不见有基因组DNA和蛋白质的污染，23S核糖体RNA与18S核糖体RNA的带型比较清晰，无拖尾现象，两条带的亮度比基本上呈现2∶1的关系，表明此RNA完整性比较好。通过目标基因扩增条带亮度与内标基因β-actin扩增条带亮度的比值可以了解目标基因表达情况，比值越大则目标基因表达量相对越大，因此，通过对该比值的分析可以判断大蓟总黄酮可提高小鼠细胞IL-1和IL-2基因表达水平。β-actin基因扩增产物大小约为650 bp左右，IL-1基因扩增产物大小约为400 bp左右，IL-2基因扩增产物大小约为450 bp左右，均与引物设计时预期产物大小近似。以上研究可以确定大蓟总黄酮能够极为显著地促进肿瘤小鼠细胞产生IL-1 mRNA和IL-2mRNA。
       【参考文献】
         　　［1］国家药典委员会，中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，1995.
       
       ［2］Takaishi, Y. T. Okuyama, A. Masuda, K. Nakano, K. Murakami and T. Tomimatsu, Acetylenes from Cirsium japonicum. Phytochemistry, 1990：29, 3849.
       
       ［3］Sujun Liu, Xun Luo, Daxu Li, et al ，Tumor inhibition and improved immunity in mice treated with flavone from Cirsium japonicum DC［J］.International Immunopharmacology，2006，6：1387.
       
       ［4］潘菊芬.甘草黄芩免疫学调节作用的体外试验［J］.天津医药，1991，19：468.
       
       ［5］KruseN,PetteM,Toyka K et al.Quantification of cytokine mRNA expression by RT-PCR in samples of previously frozen blood［J］.Jimmunol Methods,1997，210(2):1952203.
       
       ［6］Housseau F,Lindsey KR,Oberholtzer SD et al.Quantitative real-time RT-PCR as a method for monitoing T lymphocytere activity to full length tyrosinase protein in vaccinated melanoma patients［J］.JImmunolMethods,2002，266(122)：872103.