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       【摘要】 
       目的建立蒜氨酸原料药理化性质和稳定性的评价方法。方法通过对蒜氨酸原料药理化性质的测定，确定了该化合物的理化鉴别方法，同时建立RP-HPLC法对蒜氨酸原料药的稳定性进行研究。结果该法操作简便、灵敏度高、准确性和重复性好。结论稳定性实验表明蒜氨酸原料药对高热、光照稳定；对高湿不稳定。
       【关键词】  蒜氨酸原料药 反相高效液相色谱法 稳定性
       Study on the Physiochemical Characteristiis and the Stability of Alliin Substance
       HUANG Hongyong, CUI Lina, TANG Hui, ZHI Xiaoyan
       1.Key Laboratory of Xinjiang Phytomedicinal Resources，Shihezi 832002，China；2.The Second
       Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University，Xinxiang 453002，China
       Abstract：ObjectiveTo set up a method for evaluation of physiochemical characteristics and the stability of Alliin substance. MethodsThis experiment studied the physiochemical characteristics and the stability of Aallin substance by determinating physiochemical characteristics or by RP-HPLC method. ResultsThe method was easy, accurate and stable. ConclusionAlliin substance is stable under the conditions of high temperature and strong light, but unstable under the conditions of high humidity.
       Key words：Alliin substance；  RP-HPLC；  Stability
       蒜氨酸(Alliin，分子式C6H11NO3S，分子量177.22，结构式见图1) 化学名为：S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜(S-allyl-L-cysteine sulfoxide，SACS)，是百合科葱属植物大蒜Allium sativum中独特的含硫氨基酸［1］，纯品为无嗅无味，性质稳定的白色结晶，鲜蒜中其含量为0.5%～2.0%。现代研究表明，蒜氨酸具有抑制肿瘤、保护心血管、提高免疫力、清除自由基等多种重要的人体保健功能［2，3］。
       本文主要对中试生产的蒜氨酸原料药的理化性质及稳定性进行了研究。现报道如下。
       1  器材
       美国Agilent1100系列高效液相色谱仪；德国SartoriusBP211D电子天平；PE-241型旋光度测定仪；Nicolet-380型智能傅立叶红外光谱仪；北京泰克X-5型显微熔点测定仪；上海科哲TD-Ⅱ全自动薄层铺板机；宁波东南RXZ-300C型智能人工气候箱；上海安亭TGL-16G高速离心机。
       蒜氨酸原料药(中试自制，批号061019，061226，07013003)；蒜氨酸对照品(自制，含量99.5%，批号061222)；利巴韦林原料药(广东肇庆星湖生物化学制药厂，含量99.0％，批号20050923)；其他试剂均为分析纯；试液均按《中国药典》(2005版)Ⅱ部附录XV B配制。
       2  方法与结果
       2.1  理化性质
       2.1.1  熔点与溶解度取60℃减压干燥至恒重的蒜氨酸样品适量，以X-5显微熔点测定仪(使用前已校正)测定，每份样品重复测定3次。按照溶解度测定的方法，溶剂选择水、乙醚、丙酮、乙醇、冰醋酸、无机酸、无机碱，考察样品的溶解情况。蒜氨酸原料药的熔点为158.0～162.0℃；蒜氨酸在水中易溶；在无机酸、碱中略溶；在乙醚、丙酮、乙醇、冰醋酸中不溶。
       2.1.2  薄层色谱(TLC)将样品配制成适当浓度的溶液，在薄层板上用自动定量点样器点样，自然挥干后，以正丁醇∶冰醋酸∶水=4∶4∶1为展开剂饱和20 min后，于20℃条件下，上行展开3 h，自然晾干，喷0.2%茚三酮乙醇显色剂，在105℃烘箱烘10 min，自然光照下目视观察。在上述色谱条件下，样品中蒜氨酸的斑点均与对照品一样，呈现粉红色，比移值Rf均为0.48。
       2.1.3  旋光度或比旋度取60℃减压干燥至恒重的蒜氨酸样品适量，配制成5 mg·ml-1的水溶液，按《中国药典》（2005年版）Ⅱ部附录VI E的方法进行测定。采用1 dm的微量管(1 ml)，在钠光谱的D线(589.3 nm)检测。样品比旋度测定的平均值为+62.8°(n=3)，与文献报道［4］较为一致，表明该工艺提取的蒜氨酸为S构型。
       2.1.4  红外吸收光谱按《中国药典》（2005年版）Ⅱ部附录Ⅳ C红外分光光度法，采用溴化钾压片法测定。3 500～3 300 cm-1的弱宽吸收峰和1 695～1 540 cm-1的强吸收峰，与N-H和O-H的伸缩振动相符；3 076～3 012 cm-1的中等强度吸收峰，与=C-H伸缩振动相符；1 695～1 540 cm-1的强吸收峰，与C=C，C=O伸缩振动相符；1 024 cm-1的吸收峰，与-C-N，S=O伸缩振动相符，见图2。红外吸收光谱特征与蒜氨酸结构相符。
       2.2  稳定性实验
       2.2.1  色谱条件色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为100%水，用前经过滤脱气；流速0.8 ml·min-1；检测波长220 nm；柱温25℃；进样量20 μl；以利巴韦林为内标，采用RP-HPLC定量。
       2.2.2  利巴韦林内标液的制备称取利巴韦林原料药约200 mg，精密称定，置烧杯中，蒸馏水溶解并转移至500 ml容量瓶中，定容至刻度，即得。
       2.2.3  蒜氨酸对照品储备液的制备称取蒜氨酸对照品约20 mg，精密称定，置小烧杯中，蒸馏水溶解并转移至50 ml容量瓶中，定容至刻度，即得。
       2.2.4  含量测定方法分别精密量取蒜氨酸对照品储备液0.5，2.5，5.0，6.0，7.5，10.0 ml至25 ml容量瓶，各加入2.0 ml利巴韦林内标液，加水稀释至刻度，摇匀，分别取适量10 000 r/min离心6 min，取20 μl进样，记录对照品峰面积与内标峰面积。计算校正因子f=3.5821(RSD=1.0%，n=6)，按下式计算样品含量：
       C样=f·A样·C内/A内
       
       蒜氨酸对照品的浓度在5～200 μg·ml-1内线性关系良好，最低检测浓度为5 μg·ml-1。蒜氨酸的保留时间约为5 min，理论塔板数大于10 000，对称因子为1.05，与其他有关物质色谱峰的分离度大于1.5。见图3。
       2.2.5  精密度实验精密量取同一份蒜氨酸对照品液2.0 ml至25 ml容量瓶，按“2.2.4”项下处理，分别于0，1，2，3，4，5 h测定蒜氨酸含量，计算日内精密度；测定1次/d，一共6次，计算日间精密度。结果日内RSD为0.17%；日间RSD为0.83%，表明蒜氨酸比较稳定，重复性较好。
       2.2.6  回收率实验以07013003号样品处理原液为对象，分别精密量取1.0 ml至25 ml容量瓶中，加内标液2.0 ml后，分别加入蒜氨酸对照品溶液1.0，2.0，3.0 ml，按“2.2.4”项下处理。每个浓度平行处理3份，测定蒜氨酸总含量。平均回收率为99.86%，RSD为1.3%。表明RP-HPLC法测定蒜氨酸含量的方法回收率较高，能够满足定量分析的要求。
       2.2.7  光照影响实验取蒜氨酸原料药适量，均匀平摊于表面皿内，厚度小于5 mm，置人工气候箱内，于照度4 500 Lx±500 Lx条件下放置10 d，分别在5，10 d取样。RP-HPLC测定原料药的含量变化、TLC检查斑点变化、观察性状、测定熔点。经过10 d照射各考察项目基本正常，表明蒜氨酸对光照稳定。结果见表1。表1  蒜氨酸光照稳定性实验（略）
       2.2.8  温度影响实验取蒜氨酸原料药适量，均匀平摊于表面皿内，厚度小于5 mm，置人工气候箱内，于50℃恒温条件下放置10 d，分别在5，10 d取样。按“2.2.7”项下同法测定。经过10 d高温各考察项目基本正常，表明蒜氨酸对高温稳定。结果见表2。表2  蒜氨酸温度稳定性实验（略）
       2.2.9  湿度影响实验取蒜氨酸原料药适量，均匀平摊于表面皿内，厚度小于5 mm，置人工气候箱内，于相对湿度75%、温度25℃条件下放置10 d，分别在第5，10天取样。按“2.2.7”项下同法测定。经过10 d高湿实验，含量明显下降，性状发生改变，熔距变大表明蒜氨酸高湿不稳定。结果见表3。表3  蒜氨酸湿度稳定性试验（略）
       2.2.10  加速实验取蒜氨酸3批制剂适量，均置人工气候箱内，于相对湿度65%、温度30℃条件下放置6个月，分别在0，1，2，3，6月末取样。按“2.2.7”项下同法测定。经过6个月加速实验，各考察项目基本正常，表明蒜氨酸在该包装下稳定。结果见表4。表4  蒜氨酸加速实验（略）
       3  讨论
       3.1  理化鉴别在薄层鉴别方法中，曾参照有关文献［5］，分别选用正丁醇：冰醋酸：水=4：1：1和正丁醇：冰醋酸：水=4：4：1两种展开剂展开。发现两种展开剂展开的斑点都较圆整，但后者展开的Rf值稍大于前者。因此，选用后者作为展开剂。显色剂分别选用碘化铋钾、改良碘化铋钾试液、20%硫酸乙醇溶液、0.2%茚三酮乙醇溶液，发现0.2%茚三酮乙醇显色最为灵敏且颜色鲜亮。因此，选择茚三酮乙醇溶液作为显色剂。
       3.2  稳定性实验在光照、高温实验中，样品的性状、熔点、含量没有明显变化；在湿度实验中，样品变色结块、熔距变大、含量明显下降。本实验的结果表明，蒜氨酸在强光照射、高温条件下较稳定，在室温条件下，对湿度较敏感，样品易发生潮解，故蒜氨酸原料药最好密闭包装，在阴凉干燥处贮存。加速试验实验结果表明，蒜氨酸在现有的包装条件下质量稳定。
       本文建立的理化鉴别方法简单易行，RP-HPLC法准确、稳定，灵敏度高，重复性好，适用于该化合物含量测定及杂质的检查，为药物的剂型开发与质量标准的研究奠定基础。
       【参考文献】
         　　［1］Lawson，L.D.，1996. The composition and chemistry of garlic cloves and processed garlic. In： Koch，H.P.，Lawson，L.D. (Eds.)，Garlic：The Science and Therapeutic Application of Allium sativum L. and Related Species，seconded［J］. Williams and Wilkins，Baltimore，USA，pp. 37．
       
       ［2］Lawson Larry．Effect of purified allicin，the major ingredient of freshly crushed garlic，on cancer cell proliferation［J］．Nutrition ＆ Cancer，2000，38(2)：245．
       
       ［3］Mousa Ahmed S．Discovery of angiogenesis inhibition by garlic ingredients：Poential anticancer benefits［J］．FASEB Journal，2001，15(4)：117．
       
       ［4］Fillmore Freeman，Bao-Guo Huang．Garlic Chenmistry. Nitric Oxidation of S-(2-Prophenyl)cysteine and (+)-S-（2-Propenyl）-L-Cystine Sulfoxide［J］． J.org.chem，1994，59：3227．
       
       ［5］王岩，李新霞，陈 坚．薄层扫描法测定大蒜中蒜氨酸的含量［J］．中国药学杂志，2003，38(3)：217．