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       【摘要】 
       目的建立一种快捷准确的测定黄花蒿中青蒿素含量的方法，用以指导青蒿素生产原料的收购及青蒿素生产过程中质量监控。方法改进的紫外分光光度法，检测波长292 nm，青蒿素含量计算公式：M（mg/g）=（A样品×V×r×2）/（A标准×3）。结果青蒿素对照品在0.02 ～0.14 mg/ml范围内具有良好的线性关系，r=0.999 8（n=7），平均回收率为99.81%（n=7）。重庆市酉阳县等7份不同产地黄花蒿样品中青蒿素含量范围为6.71～10.19 mg/g。测定结果与传统的分析方法无显著差异。结论 采用改进的紫外分光光度法进行青蒿素含量测定简单易行，线性及重复性良好，可以取代传统的分析方法作为青蒿素生产过程中含量测定的新方法。
       【关键词】  黄花蒿 青蒿素 紫外分光光度法 质量控制
       Improvement of Assay Method on Arteannuin and Quality Evaluation on Artemisia annua L.
       ZHOU Nong,  DUAN Yimei，CHEN Qiang
       (1.Pharmacological School, Dali College, Dali ,Yunnan  671000，China; 2.Department of Traditional Chinese Medicine, Military Region Institution Hospital, Chengdu ,Sichuan  610011，China)
       Abstract：ObjectiveTo establish a fast and precise method to determine the arteannuin content in Artemisia annua L., which can give guidance to buying arteannuin raw material and quality control in Artemisia annua L.production.MethodsModified Ultraviolet spectrophotometry was adopted, the detection wavelength was 292 nm，and the calculation formula about arteannuin was M（mg/g）=（Asample×V×r×2）/（Astandard×3）. Resultscontrol article had a good linear relationship in the range of 0.02～0.14 mg/ml, r=0.999 8, the average recovery was 98.81%（n=7）. Among seven different areas in Youyang county in Chongqing,the extent of arteannuin content in Artemisia annua L. sample was 6.71～10.19 mg/g. The result of determination had no significant deviation with orthodox analytical method. ConclusionThe modified Ultraviolet spectrophotometry is simple, the linearity and reproducibility is good. It is a new method to determine the content of arteannuin instead of the orthodox analytical method.
       Key words：Artemisia annua L.;  Arteannuin;  Ultraviolet spectrophotometry;  Quality control
       
       黄花蒿又名青蒿，为菊科植物黄花蒿Artemisia annua L.的干燥地上部分，具有清热解暑、除蒸、截疟等功效［1］。20世纪70年代我国学者从黄花蒿中分离得到一种新型的抗疟成分——青蒿素［2］（arteannuin），对脑型疟、恶性疟、间日疟，具有高效、速效、低毒、使用安全的特点，是目前国际上防治疟疾的首选药物，并已成为WHO推荐的抗疟药物。
       重庆地区拥有丰富的优质黄花蒿种质资源，是全国最重要的青蒿素原料药的产地之一。为了进一步充分利用本地黄花蒿资源，我们采用改进的紫外分光光度法对重庆不同产地的黄花蒿中青蒿素进行含量测定，为该地区的黄花蒿质量评价和进一步加速开发利用提供参考依据；同时，我们对原有青蒿素含量测定的方法进行了改进，建立了一种简便、快捷、准确的青蒿素含量测定方法，用以指导青蒿素生产原料的收购及生产质量的控制。
       1  仪器与试药
       1.1  仪器
       UV-3600型紫外可见近红外分光光度计（日本岛津公司）；微型植物试样粉碎机（北京中兴伟业仪器有限公司）；AE240型天秤［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；KQ-250B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；SZ-93型自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）；W2018型恒温水浴锅（上海中生科技有限公司）。
       1.2  试剂甲醇，石油醚（30～60℃），95%乙醇，氢氧化钠，水为二次蒸馏水，以上均为分析纯。
       1.3  对照品 青蒿素对照品（供含量测定用，批号100202200402）由中国药品生物制品检定所提供。
       1.4  药材不同产地黄花蒿样品于200608～10采自重庆市酉阳县等地（表1），经鉴定为菊科植物黄花蒿Artemisia annua L.的干燥地上部分。
       2  方法与结果
       2.1  供试品溶液的制备将黄花蒿叶干燥后，粉碎过筛（过100目筛），制成黄花蒿样品粉末。精密称取黄花蒿样品粉末1.0g于250 ml具塞锥形瓶中，精密量取石油醚（30～60℃）60 ml，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）15 min，立即用流水冷却至室温；将超声后的石油醚提取液摇匀，滤过，倒入量筒，记录石油醚的体积V。精密量取黄花蒿提取液0.4 ml于10 ml的具塞刻度试管中，放入不再加热的沸水中挥干，得到含青蒿素的浸膏，加入2 ml的95%乙醇，溶解残渣，用0.2%氢氧化钠溶液定容至10 ml，摇匀，置(50±1)℃恒温水浴中微温30 min，取出，流水冷却至室温，待液面回复至刻度，用0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。
       2.2  对照品溶液的制备精密称取80℃干燥至恒重的青蒿素对照品100 mg，置100 ml量瓶中，加入95%乙醇稀释至刻度，得到1 mg/ml的青蒿素对照品母液，4℃冰箱保存备用。精密量取青蒿素对照品母液10.0 ml于100 ml量瓶中，以95%乙醇补充至20 ml，用0.2%氢氧化钠溶液定容至100 ml，摇匀，置(50±1)℃恒温水浴中微温30 min，取出，流水冷却至室温，待液面回复至刻度，用0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。
       2.3  空白溶液的制备取20 ml 95%乙醇置于100 ml量瓶中，用0.2%氢氧化钠溶液定容至100 ml，摇匀，置(50±1)℃恒温水浴中微温30 min，取出，流水冷却至室温，待液面回复至刻度，用0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。
       2.4  标准曲线的绘制分别精密量取青蒿素对照品母液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 ml于10 ml量瓶中，以95%乙醇溶液补充至2 ml，补加0.2%NaOH溶液至刻度，混匀，即得0.00，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12，0.14 mg/ml对照品溶液系列，置（50±1）℃恒温水浴中保温30 min，流水冷却至室温。λ=292 nm处测吸光度值，得到青蒿素的质量浓度对吸光度值的直线回归方程为：C=0.001 6A-0.000 4，r=0.999 8（n=7）。结果表明，青蒿素在0.02～0.14 mg/ml与吸光度具有良好的线性关系。
       2.5  精密度实验取对照品溶液连续测定其292 nm处吸光度值7次，其RSD=0.38%，表明仪器精密度良好。
       2.6  重复性实验精密称取同一批黄花蒿样品粉末7份，按“2.1”项的方法制备，连续测定，平均青蒿素含量为8.38 mg/g，RSD=0.69%，表明重复性良好。
       2.7   稳定性实验取同一份黄花蒿药材供试品溶液和青蒿素对照品溶液，分别于配制后的0，2，4，6，8，10，12h（n=7）测定，对照品及供试品的吸光度值RSD分别为1.12%和0.88%，表明对照品和供试品溶液在12 h内基本稳定。
       2.8  加样回收率实验精密称取已知含量的黄花蒿样品粉末（实验编号：3）0.5 g，再精密加入青蒿素对照品5.0 mg，按“2.1”项下的方法制备。连续重复测定样品吸光度值，得到青蒿素平均回收率为99.81%，RSD为0.85%（n=7）。结果表明，该方法的回收率稳定可靠。
       2.9  样品测定分别按“2.1”项下方法制备供试品溶液，以空白溶液为参比，在292 nm处分别测得青蒿素对照品溶液和供试品溶液吸光度值A标准和A样品，代入青蒿素含量计算公式：M（mg/g）=（A样品×V×r×2）/（A标准×3），其中，A样品为样品测得吸光度值，V为超声后样品石油醚的体积，A标准为0.1 mg/ml青蒿素对照品吸光度值，r为转换系数。将上述数据分别代入青蒿素含量计算公式计算各样品中青蒿素含量。同时按水分测定法（甲苯法）［1］进行水分测定，结果按药材干燥品计算含量（见表1）。样品测定时间为200611。由表1可知，不同产地黄花蒿药材中青蒿素含量范围为6.71 ～10.19 mg/g。表1  不同产地黄花蒿药材含量测定结果（略）
       3  讨论
       由于青蒿素仅在紫外区203 nm处有较弱的末端吸收，但其95%乙醇溶液与0.2%氢氧化钠溶液反应后产生具有紫外吸收的化合物（α，β-不饱和酮酸盐），该物质在292 nm处有最大吸收。取对照品溶液，测定其紫外光谱图（260～340 nm），得到紫外光谱中的特征峰λmax=292 nm，故检测波长选择在292 nm处。
       尽管黄花蒿系世界广布种，但青蒿素的含量随产地不同差异极大。除我国重庆、广西、湖南等少数地区外，世界绝大多数地区生长的黄花蒿中青蒿素含量都很低（1‰或以下），且在近缘的植物中也未发现含有青蒿素，使得青蒿素的天然资源相对贫乏［3］。虽然在20世纪80年代青蒿素的人工合成、生物合成即已成功，但因收率低、成本高而难以投入工业化生产。目前青蒿素及其衍生物的生产仍需依赖于天然药物资源——黄花蒿。本研究结果表明，重庆地区黄花蒿中青蒿素含量较高，具有一定的开发利用价值，同时具有工业生产价值。
       实验过程中发现衍生反应中要严格控制反应温度在（50±1）℃范围内，氢氧化钠溶液的质量浓度应控制在（0.2±0.02）%范围和加入0.2%氢氧化钠溶液的量也要根据样品中的具体含量摸索出最佳的加入量，否则会影响测定结果的准确性。
       目前已有多种测定青蒿素含量的方法见于文献，但都存在着一定的缺点［4，5］，如分析速度慢，成本高，过程复杂等。为了找到一种迅速、简便、灵敏度高的青蒿素测定方法，本文利用改进的紫外分光光度法来进行青蒿素含量的测定，具有方便快捷、样品处理简单、操作误差较小、排除样品中原有的杂质干扰等优点，实验证明本方法为黄花蒿中青蒿素的含量测定提供了一个实用的方法。该方法可以作为青蒿素原料收购或用于青蒿素提取、精制过程中的含量测定，并可用于成品的质量控制。
       【参考文献】
         　　［1］国家药典委员会.中国药典，一部［S］.北京：化学工业出版社，2005：137，附录ⅨH.
       
       ［2］全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编［M］.北京：人民卫生出版社，1975：482.
       
       ［3］钟国跃，周华蓉，凌 云，等.黄花蒿优质种质资源的研究［J］.中草药，1998，29（4）：264.
       
       ［4］李典鹏，梁小燕，陈秀珍，等.采用薄层层析-紫外分光光度法测定广西不同产地黄花蒿中青蒿素含量［J］.广西植物，1995，15（3）：254.
       
       ［5］齐向娟，李士雨，何玉娟.天津地区黄花蒿中青蒿素测定［J］.中草药，2006，37（3）：449.